Учените идентифицират 5072 основни човешки гена

Учените идентифицират 5072 основни човешки гена

В проучване, публикувано наскоро в сп клетка Изследователите изследваха фенотипния пейзаж на няколко неуловими основни човешки гени, за да създадат подробен генотип-фенотипен ресурс, който очертава фенотипните последици от нарушаването на основните клетъчни процеси.

ресурс: Фенотипният пейзаж на основните човешки гени. Кредит за снимка: Billion Photos / Shutterstock

фон

Определянето на ролята на основните гени в различни клетъчни процеси, включително визуализирането на техния принос към клетъчната морфология, е от решаващо значение за разбирането на основата на клетъчния растеж, пролиферация и функционалност.

Относно ученето

В настоящото проучване изследователите първо проведоха клъстерирани редовно разпределени къси палиндромни повторения (CRISPR) – базиран на CRISPR-асоцииран протеин 9 (Cas9) функционален скрининг и идентифицираха 5 072 съществени гена, придаващи фитнес. След това те избраха четири последователности на рибонуклеинова киселина (sgRNA) с едно насочване, които са насочени към всеки ген, както и 250 „нецелеви“ sgRNAs от съществуващи sgRNA библиотеки.

Те доставят sgRNA библиотеката на HeLa клетки, съдържащи интегриран доксициклин-индуцируем Cas9 конструкт. След това те фиксираха клетките и амплифицираха sgRNA последователностите in situ. След това те оцветиха и изобразиха клетки с четири багрила, които им помогнаха да визуализират ядрената морфология, реакцията на увреждане на дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК), микротубулите и филаментозния актин.

След като класифицира клетките като интерфазни или митотични, екипът извърши анализи надолу по веригата. Този скрининг, базиран на изображения, предостави микроскопични изображения, които помогнаха на изследователите да извлекат фенотипни измервания за 1084 параметъра на клетъчно изображение, включително измервания на интензитет, субклетъчно разпределение, колокализация на място и размер и форма на клетките и ядрата. Изследователите сравняват идентичностите на sgRNA за над 31 милиона клетки, с медиана от 6119 клетки на генна цел за четири sgRNA. И накрая, изследователите извършиха обединени изображения на живи клетки, за да идентифицират гени, необходими за хромозомна сегрегация.

Резултати от изследването

Обобщен микроскопски анализ на >31 милиона отделни нокаут клетки за хиляди човешки гени, придаващи фитнес, идентифицира специфични приноси към основните биологични процеси въз основа на получените клетъчни фенотипове. Клетъчните параметри са директно сравними в голяма клетъчна популация и се наричат ​​фенотипни „пръстови отпечатъци“ на генна мишена. Сравнявайки тези фенотипни профили, изследователите дефинираха кофункционални генни връзки с достатъчна разделителна способност, за да разграничат свързаните роли в специфични клетъчни процеси. Въпреки това, само четири клетъчни багрила бяха достатъчни за идентифициране на функционални връзки между гени в различни биологични пътища, без да се анализират специфични клетъчни маркери, съответстващи на всеки клетъчен път с различна функция.

В допълнение към идентифицирането на установени връзки, настоящата работа предостави няколко прогнози за приноса на непълно характеризирани гени към основните клетъчни процеси. Например, анализът на фенотипно клъстериране включва C7orf26 като субединица на основния интеграторен комплекс, C1orf131 като регулатор на рибозомната биогенеза и AKIRIN2 в протеазомната функция. Те също така идентифицираха генни нокаути, които водят до дефекти в митотичната функция, включително неочаквани роли на мембранно свързаните транспортери AQP7 и ATP1A1 и клетъчния осмоларитет за насърчаване на точната хромозомна сегрегация.

В допълнение, тази статия разкрива ролята на няколко регулатора на генната експресия в контрола на клетъчното делене, включително прогнозирания транскрипционен фактор ZNF335, комплекса DREAM (LIN52), комплекса за обработка на иРНК в 30-ия край (CLP1) и по-малката сплайсозома (RNPC3). експресията на специфични компоненти на клетъчното делене. Тези примери подчертават силата на оптичния скрининг за идентифициране на кофункционални гени в различни биологични пътища, с потенциал за допълнителни открития от публикуваните тук данни.

Изводи

Изследователите ефективно са използвали сложни, многоизмерни фенотипове, базирани на изображения, за да получат функционално релевантни генни клъстери в различни клетъчни процеси в мащаб, много по-голям от който и да е екран за групово профилиране, базиран на единично изображение. В резултат на това изследователите вече разполагат с мощен източник на данни за изследване и цялостна среда за тестване за разработване на аналитични техники.

Два протеина биха могли да действат по един биологичен път, без да показват пряко взаимодействие. В допълнение към точното идентифициране на кофункционални гени в различни клетъчни процеси, настоящото проучване предостави силно мащабируем ортогонален подход за изследвания на протеинови взаимодействия в целия протеом. Освен това, базираното на количествено изображение фенотипно профилиране забележително дефинира генни клъстери за пан-съществени гени, като напр. Б. Рибозомни компоненти, които нямат различни изисквания в клетъчните линии. В много случаи този анализ също идентифицира допълнителни гени и по-фина разделителна способност за техните генни клъстери, което позволява разграничаване между основните рибозомни субединици и рибозомните биогенезни фактори.

Подходът на изследването също беше много успешен при идентифицирането на генни клъстери за морфологични процеси, включително цитокинеза, ядрен транспорт, хромозомна кондензация и други, които иначе биха били трудни за идентифициране поради транскрипционни промени. Той също така генерира сложни профилни данни и идентичността на смущението за всяка клетка позволи директна корелация на множество фенотипове с високи размери с индивидуални смущения в един експеримент. Като цяло, относително евтини, базирани на изображения обединени CRISPR профилиращи екрани се очертаха като стабилна стратегия за дефиниране на генни мрежи и функционалните роли на човешките гени. Освен това екраните, базирани на обединени изображения, бяха сравнително лесни за мащабиране в сравнение с екраните, базирани на подредени изображения, със смесени контроли, осигуряващи стабилна статистическа основа за сравнения.

Справка:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.