Vědci identifikují 5 072 základních lidských genů

Vědci identifikují 5 072 základních lidských genů

Ve studii nedávno zveřejněné v časopise buňka Výzkumníci zkoumali fenotypovou krajinu několika nepolapitelných základních lidských genů, aby vytvořili podrobný zdroj genotypu a fenotypu, který nastiňuje fenotypové důsledky narušení základních buněčných procesů.

zdroj: Fenotypová krajina základních lidských genů. Fotografický kredit: Billion Photos / Shutterstock

pozadí

Určení role esenciálních genů v různých buněčných procesech, včetně vizualizace jejich příspěvku k buněčné morfologii, je zásadní pro pochopení základu buněčného růstu, proliferace a funkčnosti.

O studiu

V této studii vědci nejprve provedli Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – funkční screening na bázi proteinu 9 (Cas9) asociovaný s CRISPR a identifikovali 5 072 esenciálních genů udělujících fitness. Dále vybrali čtyři sekvence ribonukleové kyseliny (sgRNA), které se zaměřovaly na každý gen, a také 250 „necílových“ sgRNA z existujících knihoven sgRNA.

Dodali knihovnu sgRNA do buněk HeLa obsahujících integrovaný konstrukt Cas9 indukovatelný doxycyklinem. Dále fixovali buňky a amplifikovali sekvence sgRNA in situ. Poté obarvili a zobrazili buňky čtyřmi barvivy, která jim pomohla vizualizovat jadernou morfologii, reakci na poškození deoxyribonukleovou kyselinou (DNA), mikrotubuly a filamentózní aktin.

Poté, co byly buňky klasifikovány jako interfázové nebo mitotické, tým provedl následné analýzy. Tento screening založený na obrázcích poskytl mikroskopické snímky, které pomohly výzkumníkům extrahovat fenotypová měření pro 1 084 parametrů zobrazování buněk, včetně měření intenzity, subcelulární distribuce, bodové kolokalizace a velikosti a tvaru buněk a jader. Výzkumníci porovnávali identity sgRNA pro více než 31 milionů buněk, s mediánem 6 119 buněk na genový cíl pro čtyři sgRNA. Nakonec vědci provedli zobrazování sdružených živých buněk, aby identifikovali geny potřebné pro segregaci chromozomů.

Výsledky studie

Shromážděná mikroskopická analýza > 31 milionů jednotlivých knockoutovaných buněk pro tisíce lidských genů udělujících fitness identifikovala specifické příspěvky k hlavním biologickým procesům na základě výsledných buněčných fenotypů. Buněčné parametry jsou přímo srovnatelné napříč velkou buněčnou populací a označují se jako fenotypové „otisky prstů“ genového cíle. Porovnáním těchto fenotypových profilů vědci definovali kofunkční genové vztahy s dostatečným rozlišením pro rozlišení souvisejících rolí ve specifických buněčných procesech. Pouze čtyři buněčná barviva však stačila k identifikaci funkčních vztahů mezi geny napříč různými biologickými cestami, bez analýzy specifických buněčných markerů odpovídajících každé buněčné dráze s odlišnou funkcí.

Kromě identifikace zavedených vztahů poskytla současná práce několik předpovědí pro příspěvky neúplně charakterizovaných genů k základním buněčným procesům. Například analýza shlukování fenotypů implikovala C7orf26 jako podjednotku jádrového integrátorového komplexu, C1orf131 jako regulátor biogeneze ribozomů a AKIRIN2 ve funkci proteazomu. Identifikovali také genové knockouty, které vedou k defektům v mitotické funkci, včetně neočekávaných rolí membránově vázaných transportérů AQP7 a ATP1A1 a buněčné osmolarity při podpoře přesné segregace chromozomů.

Kromě toho tato práce odhalila roli několika regulátorů genové exprese v kontrole buněčného dělení, včetně předpokládaného transkripčního faktoru ZNF335, komplexu DREAM (LIN52), komplexu zpracování mRNA s 30 konci (CLP1) a menšího spliceosomu (RNPC3). exprese specifických složek buněčného dělení. Tyto příklady zdůrazňují sílu optického screeningu k identifikaci kofunkčních genů napříč různými biologickými cestami, s potenciálem pro další objevy z údajů zde publikovaných.

Závěry

Výzkumníci efektivně využívali komplexní, vícerozměrné fenotypy založené na obrázcích k získání funkčně relevantních genových shluků napříč různými buněčnými procesy v měřítku mnohem větším než jakákoliv sdružená profilovací obrazovka založená na jednom obrázku. Výsledkem je, že výzkumníci nyní mají k dispozici výkonný zdroj dat k prozkoumání a komplexní testovací prostředí pro vývoj analytických technik.

Dva proteiny by mohly působit v jediné biologické dráze, aniž by vykazovaly přímou interakci. Kromě přesné identifikace kofunkčních genů napříč různými buněčnými procesy poskytla současná studie vysoce škálovatelný ortogonální přístup pro studie interakcí proteinů v rámci celého proteomu. Kromě toho kvantitativní fenotypové profilování založené na obrazech pozoruhodně definovalo genové shluky pro pan-esenciální geny, jako je např. B. Komponenty ribozomu, které nemají různé požadavky napříč buněčnými liniemi. V mnoha případech tato analýza také identifikovala další geny a jemnější rozlišení pro jejich shluky genů, což umožňuje rozlišení mezi podjednotkami jádrových ribozomů a faktory biogeneze ribozomů.

Studijní přístup byl také velmi úspěšný při identifikaci genových shluků pro morfologické procesy, včetně cytokineze, jaderného transportu, kondenzace chromozomů a dalších, které by jinak bylo obtížné identifikovat kvůli transkripčním změnám. Také generoval komplexní profilová data a perturbační identita pro každou buňku umožnila přímou korelaci více vysokorozměrných fenotypů s jednotlivými perturbacemi v jediném experimentu. Celkově se ukázalo, že relativně levné sdružené CRISPR profilovací screeningy založené na obrázcích se ukázaly jako robustní strategie pro definování genových sítí a funkčních rolí lidských genů. Kromě toho byly obrazovky založené na sdružených obrázcích srovnatelně snadno škálovatelné ve srovnání s obrazovkami založenými na uspořádaných obrázcích, přičemž smíšené kontroly poskytovaly robustní statistický základ pro srovnání.

Odkaz:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.