Forskere identificerer 5.072 essentielle menneskelige gener

Forskere identificerer 5.072 essentielle menneskelige gener

I en undersøgelse for nylig offentliggjort i tidsskriftet celle Forskere undersøgte det fænotypiske landskab af flere undvigende essentielle menneskelige gener for at skabe en detaljeret genotype-fænotype-ressource, der skitserer de fænotypiske konsekvenser af at forstyrre fundamentale cellulære processer.

Ressource: Det fænotypiske landskab af essentielle menneskelige gener. Billedkredit: Billion Photos / Shutterstock

baggrund

Bestemmelse af essentielle geners rolle i forskellige cellulære processer, herunder visualisering af deres bidrag til cellemorfologi, er afgørende for at forstå grundlaget for cellevækst, -proliferation og -funktionalitet.

Om at studere

I denne undersøgelse udførte forskere først Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) - CRISPR-associeret protein 9 (Cas9)-baseret funktionel screening og identificerede 5.072 fitness-overførende essentielle gener. Dernæst valgte de fire single-guide ribonukleinsyre (sgRNA) sekvenser, der målrettede hvert gen, samt 250 "ikke-målrettede" sgRNA'er, fra eksisterende sgRNA biblioteker.

De leverede sgRNA-biblioteket til HeLa-celler indeholdende en integreret doxycyclin-inducerbar Cas9-konstruktion. Dernæst fikserede de cellerne og amplificerede sgRNA-sekvenserne in situ. De farvede og afbildede derefter celler med fire farvestoffer, der hjalp dem med at visualisere nuklear morfologi, deoxyribonukleinsyre (DNA) skaderespons, mikrotubuli og filamentøst actin.

Efter at have klassificeret cellerne som enten interfase eller mitotisk, udførte holdet downstream-analyser. Denne billedbaserede screening gav mikroskopiske billeder, der hjalp forskere med at udtrække fænotypiske målinger for 1.084 cellebilleddannelsesparametre, herunder målinger af intensitet, subcellulær fordeling, pletkolokalisering og celle- og cellekernestørrelse og -form. Forskerne sammenlignede sgRNA-identiteter for over 31 millioner celler, med en median på 6.119 celler pr. genmål for fire sgRNA'er. Endelig udførte forskerne levende-celle poolet billeddannelse for at identificere gener, der kræves til kromosomadskillelse.

Studieresultater

Samlet mikroskopisk analyse af >31 millioner individuelle knockout-celler for tusindvis af fitness-overførende menneskelige gener identificerede specifikke bidrag til biologiske kerneprocesser baseret på de resulterende cellulære fænotyper. Celleparametre er direkte sammenlignelige på tværs af en stor cellepopulation og omtales som fænotypiske "fingeraftryk" af et genmål. Ved at sammenligne disse fænotypiske profiler definerede forskerne cofunktionelle genforhold med tilstrækkelig opløsning til at skelne relaterede roller i specifikke cellulære processer. Imidlertid var kun fire cellulære farvestoffer tilstrækkelige til at identificere funktionelle forhold mellem gener på tværs af forskellige biologiske veje uden at analysere specifikke cellulære markører svarende til hver cellulær vej med en anden funktion.

Ud over at identificere etablerede relationer gav det aktuelle arbejde adskillige forudsigelser for bidragene fra ufuldstændigt karakteriserede gener til fundamentale cellulære processer. For eksempel implicerede fænotypeklyngeanalyse C7orf26 som en underenhed af kerneintegratorkomplekset, C1orf131 som en regulator af ribosombiogenese og AKIRIN2 i proteasomfunktion. De identificerede også gen-knockouts, der fører til defekter i mitotisk funktion, herunder uventede roller af de membranbundne transportører AQP7 og ATP1A1 og cellulær osmolaritet i at fremme nøjagtig kromosomsegregation.

Derudover afslørede dette papir rollen af ​​flere genekspressionsregulatorer i kontrollen af ​​celledeling, herunder den forudsagte transkriptionsfaktor ZNF335, DREAM-komplekset (LIN52), 30-endes mRNA-behandlingskomplekset (CLP1) og det mindre spliceosom (RNPC3). ekspressionen af ​​specifikke celledelingskomponenter. Disse eksempler fremhæver styrken af ​​optisk screening til at identificere cofunktionelle gener på tværs af forskellige biologiske veje, med potentialet for yderligere opdagelser fra de data, der er offentliggjort her.

Konklusioner

Forskerne brugte effektivt komplekse, multidimensionelle, billedbaserede fænotyper til at opnå funktionelt relevante genklynger på tværs af forskellige cellulære processer i en skala, der er meget større end nogen enkelt billedbaseret poolet profilskærm. Som et resultat har forskere nu en kraftfuld datakilde at udforske og et omfattende testmiljø til at udvikle analytiske teknikker.

To proteiner kunne virke i en enkelt biologisk vej uden at vise en direkte interaktion. Ud over nøjagtig identifikation af cofunktionelle gener på tværs af en række cellulære processer, gav den nuværende undersøgelse en meget skalerbar ortogonal tilgang til proteomomfattende proteininteraktionsundersøgelser. Ydermere definerede kvantitativ billedbaseret fænotypisk profilering bemærkelsesværdigt genklynger for pan-essentielle gener, som f.eks. B. Ribosomkomponenter, der ikke har forskellige krav på tværs af cellelinjer. I mange tilfælde identificerede denne analyse også yderligere gener og finere opløsning for deres genklynger, hvilket muliggjorde skelnen mellem kerneribosomunderenheder og ribosombiogenesefaktorer.

Undersøgelsestilgangen var også meget vellykket til at identificere genklynger for morfologiske processer, herunder cytokinese, nuklear transport, kromosomkondensering og andre, som ellers ville være svære at identificere på grund af transkriptionelle ændringer. Det genererede også komplekse profildata, og perturbationsidentiteten for hver celle muliggjorde direkte korrelation af flere højdimensionelle fænotyper med individuelle forstyrrelser i et enkelt eksperiment. Samlet set er relativt billige, billedbaserede poolede CRISPR-profilskærme dukket op som en robust strategi til at definere gennetværk og de funktionelle roller af menneskelige gener. Derudover var poolede billedbaserede skærme forholdsvis nemme at skalere sammenlignet med arrayerede billedbaserede skærme, med blandede kontroller, der gav et robust statistisk grundlag for sammenligninger.

Reference:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.