Teadlased tuvastavad 5072 olulist inimese geeni

Teadlased tuvastavad 5072 olulist inimese geeni

Hiljuti ajakirjas avaldatud uuringus lahtrisse Teadlased uurisid mitme raskesti mõistetava olulise inimese geeni fenotüübilist maastikku, et luua üksikasjalik genotüübi-fenotüübi ressurss, mis kirjeldab põhiliste rakuprotsesside katkestamise fenotüüpseid tagajärgi.

Allikas: Inimese oluliste geenide fenotüübiline maastik. Foto krediit: Billion Photos / Shutterstock

taustal

Oluliste geenide rolli kindlaksmääramine erinevates rakuprotsessides, sealhulgas nende panuse visualiseerimine raku morfoloogiasse, on rakkude kasvu, proliferatsiooni ja funktsionaalsuse aluse mõistmiseks ülioluline.

Õppimisest

Käesolevas uuringus viisid teadlased esmalt läbi Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – CRISPR-iga seotud valgu 9 (Cas9) põhise funktsionaalse sõeluuringu ja tuvastasid 5072 sobivust andvat olulist geeni. Järgmisena valisid nad olemasolevatest sgRNA raamatukogudest välja neli ühe suunaga ribonukleiinhappe (sgRNA) järjestust, mis olid suunatud igale geenile, samuti 250 "mittesihtivat" sgRNA-d.

Nad toimetasid sgRNA raamatukogu HeLa rakkudesse, mis sisaldasid integreeritud doksütsükliiniga indutseeritavat Cas9 konstrukti. Järgmisena fikseerisid nad rakud ja amplifitseerisid sgRNA järjestusi in situ. Seejärel värvisid ja pildistasid nad rakke nelja värvainega, mis aitasid neil visualiseerida tuuma morfoloogiat, desoksüribonukleiinhappe (DNA) kahjustusreaktsiooni, mikrotuubuleid ja filamentset aktiini.

Pärast rakkude klassifitseerimist faasidevahelisteks või mitootilisteks, tegi meeskond allavoolu analüüse. See pildipõhine sõelumine andis mikroskoopilisi pilte, mis aitasid teadlastel eraldada 1084 raku kujutise parameetri fenotüüpsed mõõtmised, sealhulgas intensiivsuse, subtsellulaarse jaotuse, täpikolokalisatsiooni ning rakkude ja tuumade suuruse ja kuju mõõtmised. Uurijad võrdlesid sgRNA identiteeti enam kui 31 miljoni raku puhul, keskmiselt 6119 rakku geeni sihtmärgi kohta nelja sgRNA puhul. Lõpuks viisid teadlased läbi elusrakkude ühendatud pildistamise, et tuvastada kromosoomide segregatsiooniks vajalikud geenid.

Uuringu tulemused

Rohkem kui 31 miljoni individuaalse väljalülitatud raku mikroskoopiline analüüs tuhandete kehalist vormi andvate inimese geenide jaoks tuvastas saadud rakufenotüüpide põhjal spetsiifilised panused põhilistesse bioloogilistesse protsessidesse. Rakuparameetrid on suures rakupopulatsioonis otseselt võrreldavad ja neid nimetatakse geeni sihtmärgi fenotüüpilisteks "sõrmejälgedeks". Nende fenotüüpsete profiilide võrdlemisel määratlesid teadlased piisava eraldusvõimega kofunktsionaalsed geenisuhted, et eristada seotud rolle spetsiifilistes rakuprotsessides. Kuid ainult neljast rakuvärvist piisas, et tuvastada funktsionaalsed suhted geenide vahel erinevatel bioloogilistel radadel, ilma et oleks analüüsitud spetsiifilisi rakumarkereid, mis vastavad igale erineva funktsiooniga raku rajale.

Lisaks väljakujunenud suhete tuvastamisele andis praegune töö mitmeid ennustusi mittetäielikult iseloomustatud geenide panuse kohta põhilistesse rakuprotsessidesse. Näiteks fenotüübi klastrite analüüs hõlmas C7orf26 tuuma integraatori kompleksi subühikuna, C1orf131 ribosoomi biogeneesi regulaatorina ja AKIRIN2 proteasoomi funktsioonis. Samuti tuvastasid nad geenide väljalöögid, mis põhjustavad mitootilise funktsiooni defekte, sealhulgas membraaniga seotud transporterite AQP7 ja ATP1A1 ootamatuid rolle ja raku osmolaarsust kromosoomide täpse eraldamise edendamisel.

Lisaks näitas see artikkel mitme geeniekspressiooni regulaatori rolli rakkude jagunemise kontrollimisel, sealhulgas ennustatud transkriptsioonifaktor ZNF335, DREAM kompleks (LIN52), 30-otsa mRNA töötlemise kompleks (CLP1) ja väiksem splaissosoom (RNPC3). spetsiifiliste raku jagunemise komponentide ekspressioon. Need näited rõhutavad optilise skriinimise võimet tuvastada kofunktsionaalseid geene erinevatel bioloogilistel radadel, mis võivad siin avaldatud andmete põhjal teha täiendavaid avastusi.

Järeldused

Teadlased kasutasid tõhusalt keerulisi, mitmemõõtmelisi pildipõhiseid fenotüüpe, et saada funktsionaalselt asjakohaseid geeniklastreid erinevates rakuprotsessides mastaabis, mis on palju suurem kui ükski pildipõhine koondatud profiilide ekraan. Selle tulemusena on teadlastel nüüd võimas andmeallikas, mida uurida, ja põhjalik testimiskeskkond analüüsitehnikate arendamiseks.

Kaks valku võivad toimida ühes bioloogilises rajas ilma otsese interaktsioonita. Lisaks kofunktsionaalsete geenide täpsele tuvastamisele mitmesugustes rakuprotsessides pakkus käesolev uuring proteoomi hõlmavate valkude interaktsiooniuuringute jaoks väga skaleeritavat ortogonaalset lähenemisviisi. Lisaks määratles kvantitatiivne pildipõhine fenotüübiline profiilide koostamine märkimisväärselt oluliste geenide geeniklastreid, nagu näiteks. B. Ribosoomi komponendid, millel ei ole rakuliinidele erinevaid nõudeid. Paljudel juhtudel tuvastas see analüüs ka täiendavaid geene ja nende geeniklastrite peenemat eraldusvõimet, võimaldades eristada ribosoomi tuumade subühikuid ja ribosoomi biogeneesi tegureid.

Uuringu lähenemisviis oli väga edukas ka morfoloogiliste protsesside, sealhulgas tsütokineesi, tuumatranspordi, kromosoomide kondenseerumise ja muude geeniklastrite tuvastamisel, mida muidu oleks transkriptsioonimuutuste tõttu raske tuvastada. See genereeris ka keerukaid profiiliandmeid ja iga raku häiringu identiteet võimaldas mitme suuremõõtmelise fenotüübi otsest korrelatsiooni üksikute häiretega ühes katses. Üldiselt on suhteliselt odavad pildipõhised ühendatud CRISPR-profiilide ekraanid kujunenud tugevaks strateegiaks geenivõrkude ja inimese geenide funktsionaalsete rollide määratlemiseks. Lisaks oli koondatud pildipõhiseid ekraane suhteliselt lihtne skaleerida võrreldes massiivi pildipõhiste ekraanidega, segatud juhtelemendid pakkusid võrdluste jaoks tugeva statistilise aluse.

Viide:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.