Tutkijat tunnistavat 5 072 välttämätöntä ihmisgeeniä

Tutkijat tunnistavat 5 072 välttämätöntä ihmisgeeniä

Äskettäin lehdessä julkaistussa tutkimuksessa solu Tutkijat tutkivat useiden vaikeasti havaittavien välttämättömien ihmisgeenien fenotyyppistä maisemaa luodakseen yksityiskohtaisen genotyyppi-fenotyyppiresurssin, joka hahmottelee perussoluprosessien häiriintymisen fenotyyppiset seuraukset.

Resurssi: Olennaisten ihmisen geenien fenotyyppinen maisema. Kuvan luotto: Billion Photos / Shutterstock

tausta

Olennaisten geenien roolin määrittäminen erilaisissa soluprosesseissa, mukaan lukien niiden vaikutusten visualisointi solumorfologiaan, on ratkaisevan tärkeää solujen kasvun, lisääntymisen ja toiminnallisuuden perustan ymmärtämiseksi.

Opiskelusta

Tässä tutkimuksessa tutkijat suorittivat ensin Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) - CRISPR-assosioituneet proteiini 9 (Cas9) -pohjaiset toiminnalliset seulonnat ja tunnistivat 5 072 kuntoa tuottavaa olennaista geeniä. Seuraavaksi he valitsivat olemassa olevista sgRNA-kirjastoista neljä yksisuuntaista ribonukleiinihappo (sgRNA) -sekvenssiä, jotka kohdistuivat kuhunkin geeniin, sekä 250 "ei-kohdistavaa" sgRNA:ta.

He toimittivat sgRNA-kirjaston HeLa-soluihin, jotka sisälsivät integroidun doksisykliinillä indusoituvan Cas9-konstruktin. Seuraavaksi he kiinnittivät solut ja monistivat sgRNA-sekvenssit in situ. Sitten he värjäsivät ja kuvasivat soluja neljällä väriaineella, jotka auttoivat heitä visualisoimaan tuman morfologiaa, deoksiribonukleiinihapon (DNA) vauriovasteen, mikrotubulukset ja filamenttiaktiinin.

Luokiteltuaan solut joko interfaasisiksi tai mitoottisiksi ryhmä suoritti alavirran analyyseja. Tämä kuvapohjainen seulonta tarjosi mikroskooppisia kuvia, jotka auttoivat tutkijoita poimimaan fenotyyppiset mittaukset 1 084 solukuvausparametrille, mukaan lukien intensiteetin mittaukset, subsellulaarinen jakautuminen, pistekolokalisaatio sekä solujen ja tumien koko ja muoto. Tutkijat vertasivat sgRNA-identiteettiä yli 31 miljoonalle solulle, ja neljän sgRNA:n mediaani oli 6 119 solua kohdetta kohden. Lopuksi tutkijat suorittivat elävien solujen yhdistetyn kuvantamisen tunnistaakseen geenit, joita tarvitaan kromosomien erotteluun.

Tutkimustulokset

Yhdistetty mikroskooppinen analyysi yli 31 miljoonasta yksittäisestä poistosolusta tuhansista kuntoa antavista ihmisgeeneistä tunnisti spesifisen vaikutuksen biologisiin ydinprosesseihin perustuen tuloksena oleviin solufenotyyppeihin. Soluparametrit ovat suoraan vertailukelpoisia suuressa solupopulaatiossa, ja niitä kutsutaan geenikohteen fenotyyppisiksi "sormenjäljeiksi". Vertailemalla näitä fenotyyppisiä profiileja tutkijat määrittelivät yhteistoiminnalliset geenisuhteet riittävällä resoluutiolla erottamaan toisiinsa liittyvät roolit tietyissä soluprosesseissa. Kuitenkin vain neljä soluväriainetta riitti tunnistamaan funktionaaliset suhteet geenien välillä eri biologisilla reiteillä ilman, että analysoitiin spesifisiä solumarkkereita, jotka vastaavat jokaista solureittiä, jolla on erilainen toiminta.

Vakiintuneiden suhteiden tunnistamisen lisäksi nykyinen työ tarjosi useita ennusteita epätäydellisesti karakterisoitujen geenien vaikutuksesta perussoluprosesseihin. Esimerkiksi fenotyyppiklusterointianalyysi osoitti C7orf26:n ytimen integraattorikompleksin alayksiköksi, C1orf131:n ribosomin biogeneesin säätelijäksi ja AKIRIN2:n proteasomin toimintaan. He myös tunnistivat geenien poistot, jotka johtavat virheisiin mitoottisessa toiminnassa, mukaan lukien kalvoon sitoutuneiden kuljettajien AQP7 ja ATP1A1 odottamattomat roolit ja solun osmolaarisuus edistämään tarkkaa kromosomien erottelua.

Lisäksi tämä artikkeli paljasti useiden geeniekspression säätelijöiden roolin solunjakautumisen säätelyssä, mukaan lukien ennustettu transkriptiotekijä ZNF335, DREAM-kompleksi (LIN52), 30-pään mRNA-käsittelykompleksi (CLP1) ja pienempi silmukointi (RNPC3). spesifisten solunjakautumiskomponenttien ilmentyminen. Nämä esimerkit korostavat optisen seulonnan kykyä tunnistaa yhteistoiminnallisia geenejä eri biologisilla reiteillä, ja tässä julkaistujen tietojen perusteella voidaan tehdä lisälöytöjä.

Johtopäätökset

Tutkijat käyttivät tehokkaasti monimutkaisia, moniulotteisia, kuvapohjaisia ​​fenotyyppejä saadakseen toiminnallisesti merkityksellisiä geeniklustereita erilaisissa soluprosesseissa mittakaavassa, joka on paljon suurempi kuin mikään yksittäinen kuvapohjainen yhdistetty profilointiruutu. Tämän seurauksena tutkijoilla on nyt käytössään tehokas tietolähde tutkittavaksi ja kattava testausympäristö analyyttisten tekniikoiden kehittämiseen.

Kaksi proteiinia voisi toimia yhdessä biologisessa reitissä ilman suoraa vuorovaikutusta. Sen lisäksi, että kofunktionaaliset geenit tunnistettiin tarkasti useissa soluprosesseissa, tämä tutkimus tarjosi erittäin skaalautuvan ortogonaalisen lähestymistavan proteominlaajuisiin proteiinien vuorovaikutustutkimuksiin. Lisäksi kvantitatiivinen kuvapohjainen fenotyyppinen profilointi määritteli merkittävästi geeniklustereita yleishyödyllisille geeneille, kuten. B. Ribosomikomponentit, joilla ei ole erilaisia ​​vaatimuksia eri solulinjoilla. Monissa tapauksissa tämä analyysi tunnisti myös lisägeenejä ja niiden geeniklustereiden hienojakoisemman erottelun, mikä mahdollisti eron ribosomin ydinalayksiköiden ja ribosomien biogeneesitekijöiden välillä.

Tutkimusmenetelmä oli myös erittäin onnistunut tunnistamaan geeniklustereita morfologisille prosesseille, mukaan lukien sytokineesi, ydinkuljetus, kromosomien kondensaatio ja muut, joita muuten olisi vaikea tunnistaa transkription muutosten vuoksi. Se tuotti myös monimutkaisia ​​profiilitietoja, ja kunkin solun häiriöidentiteetti mahdollisti useiden korkean ulottuvuuden fenotyyppien suoran korreloinnin yksittäisten häiriöiden kanssa yhdessä kokeessa. Kaiken kaikkiaan suhteellisen halvat, kuvapohjaiset yhdistetyt CRISPR-profiilinäytöt ovat nousseet vankkaksi strategiaksi geeniverkkojen ja ihmisen geenien toiminnallisten roolien määrittämiseen. Lisäksi yhdistetyt kuvapohjaiset näytöt olivat suhteellisen helppoja skaalata verrattuna ryhmiteltyihin kuvapohjaisiin näyttöihin, ja sekakontrollit tarjosivat vankan tilastollisen perustan vertailuille.

Viite:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.