Znanstvenici identificiraju 5072 bitna ljudska gena

Znanstvenici identificiraju 5072 bitna ljudska gena

U studiji nedavno objavljenoj u časopisu ćelija Istraživači su ispitali fenotipski krajolik nekoliko nedostižnih esencijalnih ljudskih gena kako bi stvorili detaljan izvor genotip-fenotip koji ocrtava fenotipske posljedice poremećaja temeljnih staničnih procesa.

Resurs: Fenotipski krajolik bitnih ljudskih gena. Autor fotografije: Billion Photos / Shutterstock

pozadina

Određivanje uloge esencijalnih gena u različitim staničnim procesima, uključujući vizualizaciju njihovih doprinosa staničnoj morfologiji, ključno je za razumijevanje osnove rasta, proliferacije i funkcionalnosti stanica.

O studiranju

U ovoj studiji, istraživači su prvo proveli grupirana pravilno razmaknuta kratka palindromska ponavljanja (CRISPR) – funkcionalni probir temeljen na proteinu 9 (Cas9) povezanom s CRISPR-om i identificirali 5072 bitna gena koji daju sposobnost. Zatim su odabrali četiri jednostruke sekvence ribonukleinske kiseline (sgRNA) koje su ciljale svaki gen, kao i 250 "neciljanih" sgRNA iz postojećih biblioteka sgRNA.

Isporučili su biblioteku sgRNA HeLa stanicama koje sadrže integrirani Cas9 konstrukt inducibilan doksiciklinom. Zatim su fiksirali stanice i umnožili sekvence sgRNA in situ. Zatim su obojali i slikali stanice s četiri boje koje su im pomogle da vizualiziraju nuklearnu morfologiju, reakciju oštećenja deoksiribonukleinske kiseline (DNK), mikrotubule i filamentozni aktin.

Nakon što su stanice klasificirali kao interfazne ili mitotičke, tim je izvršio nizvodne analize. Ovaj probir temeljen na slikama pružio je mikroskopske slike koje su istraživačima pomogle izvući fenotipska mjerenja za 1084 parametra snimanja stanica, uključujući mjerenja intenziteta, podstanične distribucije, kolokalizacije mjesta te veličine i oblika stanica i jezgri. Istraživači su usporedili identitete sgRNA za preko 31 milijun stanica, s medijanom od 6119 stanica po ciljnom genu za četiri sgRNA. Naposljetku, istraživači su izveli skupno snimanje živih stanica kako bi identificirali gene potrebne za segregaciju kromosoma.

Rezultati studije

Skupna mikroskopska analiza >31 milijuna pojedinačnih izbačenih stanica za tisuće ljudskih gena koji određuju sposobnost identificirala je specifične doprinose temeljnim biološkim procesima na temelju rezultirajućih staničnih fenotipova. Stanični parametri su izravno usporedivi u velikoj staničnoj populaciji i nazivaju se fenotipskim "otiscima prstiju" ciljanog gena. Uspoređujući te fenotipske profile, istraživači su definirali kofunkcionalne odnose gena s dovoljnom rezolucijom da se razlikuju povezane uloge u specifičnim staničnim procesima. Međutim, samo četiri stanične boje bile su dovoljne za identificiranje funkcionalnih odnosa između gena u različitim biološkim putovima, bez analize specifičnih staničnih markera koji odgovaraju svakom staničkom putu s različitom funkcijom.

Uz identificiranje uspostavljenih odnosa, trenutni rad je pružio nekoliko predviđanja za doprinose nepotpuno karakteriziranih gena temeljnim staničnim procesima. Na primjer, analiza grupiranja fenotipa implicirala je C7orf26 kao podjedinicu kompleksa jezgre integratora, C1orf131 kao regulator biogeneze ribosoma i AKIRIN2 u funkciji proteasoma. Također su identificirali genske nokaute koji dovode do defekata u mitotičkoj funkciji, uključujući neočekivane uloge membranskih transportera AQP7 i ATP1A1 i stanične osmolarnosti u promicanju točne segregacije kromosoma.

Osim toga, ovaj je rad otkrio ulogu nekoliko regulatora ekspresije gena u kontroli stanične diobe, uključujući predviđeni faktor transkripcije ZNF335, kompleks DREAM (LIN52), kompleks za obradu mRNA na 30 kraju (CLP1) i manji spliceosom (RNPC3). ekspresiju specifičnih komponenti stanične diobe. Ovi primjeri naglašavaju snagu optičkog pregleda za identifikaciju kofunkcionalnih gena kroz različite biološke putove, s potencijalom za daljnja otkrića iz ovdje objavljenih podataka.

Zaključci

Istraživači su učinkovito koristili složene, višedimenzionalne fenotipove temeljene na slikama kako bi dobili funkcionalno relevantne klastere gena u različitim staničnim procesima u mjerilu mnogo većem od bilo kojeg skupnog profila profiliranja temeljenog na pojedinačnim slikama. Kao rezultat toga, istraživači sada imaju snažan izvor podataka za istraživanje i sveobuhvatno okruženje za testiranje za razvoj analitičkih tehnika.

Dva bi proteina mogla djelovati u istom biološkom putu bez pokazivanja izravne interakcije. Uz točnu identifikaciju kofunkcionalnih gena u različitim staničnim procesima, trenutna studija pružila je visoko skalabilni ortogonalni pristup za studije interakcija proteina na razini proteoma. Nadalje, kvantitativno fenotipsko profiliranje temeljeno na slikama izvanredno je definiralo klastere gena za sveesencijalne gene, kao što su. B. Komponente ribosoma koje nemaju različite zahtjeve za stanične linije. U mnogim je slučajevima ova analiza također identificirala dodatne gene i finiju rezoluciju za njihove klastere gena, dopuštajući razliku između središnjih podjedinica ribosoma i faktora biogeneze ribosoma.

Pristup studije također je bio vrlo uspješan u identificiranju klastera gena za morfološke procese, uključujući citokinezu, nuklearni transport, kondenzaciju kromosoma i druge, koje bi inače bilo teško identificirati zbog transkripcijskih promjena. Također je generirao složene podatke o profilu, a identitet poremećaja za svaku stanicu omogućio je izravnu korelaciju višestrukih visokodimenzionalnih fenotipova s ​​pojedinačnim poremećajima u jednom eksperimentu. Sve u svemu, relativno jeftini CRISPR profilirani ekrani temeljeni na slikama pojavili su se kao robusna strategija za definiranje mreža gena i funkcionalnih uloga ljudskih gena. Dodatno, skupne zaslone temeljene na slikama bilo je relativno lako skalirati u usporedbi s zaslonima temeljenim na nizovima slika, s mješovitim kontrolama koje su pružale robusnu statističku osnovu za usporedbe.

Referenca:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.