A tudósok 5072 alapvető emberi gént azonosítottak

A tudósok 5072 alapvető emberi gént azonosítottak

A folyóiratban nemrég megjelent tanulmányban sejt A kutatók számos megfoghatatlan esszenciális emberi gén fenotípusos tájképét vizsgálták, hogy egy részletes genotípus-fenotípus erőforrást hozzanak létre, amely felvázolja az alapvető sejtfolyamatok megzavarásának fenotípusos következményeit.

Forrás: Az alapvető emberi gének fenotípusos tájképe. Fotó forrása: Billion Photos / Shutterstock

háttér

Az esszenciális gének különböző sejtfolyamatokban betöltött szerepének meghatározása, beleértve a sejtmorfológiához való hozzájárulásuk vizualizálását, kulcsfontosságú a sejtnövekedés, -proliferáció és -funkcionalitás alapjainak megértéséhez.

A tanulásról

A jelen tanulmányban a kutatók először Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – CRISPR-asszociált protein 9 (Cas9) alapú funkcionális szűrést végeztek, és azonosítottak 5072, a fitneszhez szükséges alapvető gént. Ezt követően kiválasztottak négy egyvezető ribonukleinsav (sgRNS) szekvenciát, amelyek minden gént megcéloztak, valamint 250 „nem célzó” sgRNS-t a meglévő sgRNS-könyvtárakból.

Az sgRNS könyvtárat a HeLa sejtekhez szállították, amelyek egy integrált doxiciklinnel indukálható Cas9 konstrukciót tartalmaztak. Ezután fixálták a sejteket és in situ amplifikálták az sgRNS-szekvenciákat. Ezután négy festékkel megfestették és leképezték a sejteket, amelyek segítettek a sejtmag morfológiájában, a dezoxiribonukleinsav (DNS) károsodási reakciójában, a mikrotubulusokban és a fonalas aktinban.

Miután a sejteket interfázisúnak vagy mitotikusnak minősítették, a csapat downstream elemzéseket végzett. Ez a képalapú szűrés mikroszkópos képeket nyújtott, amelyek segítségével a kutatók 1084 sejtképalkotási paraméter fenotípusos mérését kinyerték, beleértve az intenzitás, a szubcelluláris eloszlás, a foltok kolokalizációjának mérését, valamint a sejt- és sejtmag méretét és alakját. A kutatók több mint 31 millió sejt sgRNS-azonosságát hasonlították össze, négy sgRNS esetében átlagosan 6119 sejt génenként. Végül a kutatók élősejtes egyesített képalkotást végeztek, hogy azonosítsák a kromoszóma szegregációhoz szükséges géneket.

Tanulmányi eredmények

Több mint 31 millió egyedi kiütött sejt összevont mikroszkópos analízise több ezer, fittséget biztosító emberi génre vonatkozóan a kapott sejtfenotípusok alapján specifikus hozzájárulást azonosított az alapvető biológiai folyamatokhoz. A sejtparaméterek közvetlenül összehasonlíthatók egy nagy sejtpopulációban, és egy gén célpontjának fenotípusos „ujjlenyomatának” nevezik őket. E fenotípusos profilok összehasonlításával a kutatók megfelelő felbontású kofunkcionális génkapcsolatokat határoztak meg ahhoz, hogy megkülönböztessék a kapcsolódó szerepeket specifikus sejtfolyamatokban. Mindazonáltal csak négy sejtfesték volt elegendő a gének közötti funkcionális kapcsolatok azonosításához a különböző biológiai útvonalakon, anélkül, hogy elemezték volna a különböző funkciójú sejtpályáknak megfelelő specifikus sejtmarkereket.

A kialakult kapcsolatok azonosítása mellett a jelenlegi munka számos előrejelzést adott a nem teljesen jellemzett gének hozzájárulására az alapvető sejtfolyamatokhoz. Például a fenotípus klaszterezési analízis a C7orf26-ot a mag-integrátor komplex alegységeként, a C1orf131-et a riboszóma biogenezisének szabályozójaként, az AKIRIN2-t pedig a proteaszóma működésében érintette. A génkiütéseket is azonosították, amelyek a mitotikus funkció hibáihoz vezetnek, beleértve a membránhoz kötött AQP7 és ATP1A1 transzporterek váratlan szerepét és a sejt ozmolaritást a pontos kromoszóma szegregáció elősegítésében.

Ezenkívül ez a cikk feltárta számos génexpressziós szabályozó szerepét a sejtosztódás szabályozásában, beleértve a megjósolt ZNF335 transzkripciós faktort, a DREAM komplexet (LIN52), a 30-end mRNS feldolgozó komplexet (CLP1) és a kisebb spliceoszómát (RNPC3). specifikus sejtosztódási komponensek kifejeződése. Ezek a példák rávilágítanak az optikai szűrés azon képességére, hogy különböző biológiai útvonalakon keresztül azonosíthatók a kofunkcionális gének, és az itt közzétett adatokból további felfedezésekre nyílik lehetőség.

Következtetések

A kutatók hatékonyan alkalmaztak összetett, többdimenziós, képalapú fenotípusokat, hogy funkcionálisan releváns génklasztereket szerezzenek különféle sejtfolyamatokon keresztül, sokkal nagyobb léptékben, mint bármely egyetlen képalapú, összevont profilozó képernyő. Ennek eredményeként a kutatók most egy hatékony adatforrással rendelkeznek, amelyet fel kell tárni, és átfogó tesztelési környezettel rendelkeznek az elemzési technikák fejlesztéséhez.

Két fehérje működhet egyetlen biológiai úton anélkül, hogy közvetlen kölcsönhatást mutatna. A különböző sejtfolyamatokban a kofunkcionális gének pontos azonosítása mellett a jelenlegi tanulmány egy nagyon skálázható ortogonális megközelítést biztosított a proteom egészére kiterjedő fehérjekölcsönhatás-vizsgálatokhoz. Továbbá a kvantitatív képalapú fenotípusos profilalkotás figyelemreméltóan meghatározott génklasztereket a pánesszenciális gének számára, mint pl. B. Riboszóma komponensek, amelyek nem rendelkeznek eltérő követelményekkel a sejtvonalakban. Ez az elemzés sok esetben további géneket és finomabb szemcsés felbontást is azonosított génklasztereik számára, lehetővé téve a riboszóma mag alegységeinek és a riboszóma biogenezis faktorainak megkülönböztetését.

A vizsgálati megközelítés nagyon sikeres volt a morfológiai folyamatok génklasztereinek azonosításában is, beleértve a citokinézist, a nukleáris transzportot, a kromoszóma kondenzációt és másokat, amelyeket egyébként nehéz lenne azonosítani a transzkripciós változások miatt. Komplex profiladatokat is generált, és az egyes cellák perturbáció-azonossága lehetővé tette több nagydimenziós fenotípus közvetlen korrelációját az egyedi perturbációkkal egyetlen kísérletben. Összességében elmondható, hogy a viszonylag olcsó, képalapú összevont CRISPR profilozó képernyők robusztus stratégiaként jelentek meg a génhálózatok és az emberi gének funkcionális szerepeinek meghatározásában. Ezenkívül az összevont képalapú képernyők viszonylag könnyen méretezhetők a tömbösített képalapú képernyőkhöz képest, és a vegyes vezérlők megbízható statisztikai alapot szolgáltattak az összehasonlításhoz.

Referencia:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.