Gli scienziati identificano 5.072 geni umani essenziali

Gli scienziati identificano 5.072 geni umani essenziali

In uno studio recentemente pubblicato sulla rivista cella I ricercatori hanno esaminato il panorama fenotipico di diversi sfuggenti geni umani essenziali per creare una risorsa genotipo-fenotipo dettagliata che delinea le conseguenze fenotipiche dell'interruzione dei processi cellulari fondamentali.

Risorsa: Il panorama fenotipico dei geni umani essenziali. Credito fotografico: miliardi di foto / Shutterstock

sfondo

Determinare il ruolo dei geni essenziali in diversi processi cellulari, inclusa la visualizzazione del loro contributo alla morfologia cellulare, è fondamentale per comprendere le basi della crescita, della proliferazione e della funzionalità cellulare.

A proposito di studiare

Nel presente studio, i ricercatori hanno prima condotto Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – screening funzionale basato sulla proteina 9 associata a CRISPR (Cas9) e identificato 5.072 geni essenziali che conferiscono fitness. Successivamente, hanno selezionato quattro sequenze di acido ribonucleico (sgRNA) a guida singola che miravano a ciascun gene, nonché 250 sgRNA “non mirati”, da librerie di sgRNA esistenti.

Hanno consegnato la libreria di sgRNA alle cellule HeLa contenenti un costrutto Cas9 integrato inducibile dalla doxiciclina. Successivamente, hanno fissato le cellule e amplificato le sequenze di sgRNA in situ. Hanno poi colorato e fotografato le cellule con quattro coloranti che li hanno aiutati a visualizzare la morfologia nucleare, la risposta al danno dell'acido desossiribonucleico (DNA), i microtubuli e l'actina filamentosa.

Dopo aver classificato le cellule come interfase o mitotiche, il team ha eseguito analisi a valle. Questo screening basato su immagini ha fornito immagini microscopiche che hanno aiutato i ricercatori a estrarre misurazioni fenotipiche per 1.084 parametri di imaging cellulare, comprese misurazioni di intensità, distribuzione subcellulare, colocalizzazione spot e dimensioni e forma di cellule e nuclei. I ricercatori hanno confrontato le identità di sgRNA per oltre 31 milioni di cellule, con una media di 6.119 cellule per gene bersaglio per quattro sgRNA. Infine, i ricercatori hanno eseguito l'imaging di pool di cellule vive per identificare i geni necessari per la segregazione cromosomica.

Risultati dello studio

L'analisi microscopica aggregata di oltre 31 milioni di singole cellule knockout per migliaia di geni umani che conferiscono la forma fisica ha identificato contributi specifici ai processi biologici fondamentali in base ai fenotipi cellulari risultanti. I parametri cellulari sono direttamente confrontabili in una vasta popolazione cellulare e vengono definiti “impronte digitali” fenotipiche di un gene bersaglio. Confrontando questi profili fenotipici, i ricercatori hanno definito le relazioni genetiche cofunzionali con una risoluzione sufficiente per distinguere i ruoli correlati in specifici processi cellulari. Tuttavia, solo quattro coloranti cellulari erano sufficienti per identificare le relazioni funzionali tra i geni attraverso diversi percorsi biologici, senza analizzare marcatori cellulari specifici corrispondenti a ciascun percorso cellulare con una funzione diversa.

Oltre a identificare le relazioni stabilite, il lavoro attuale ha fornito diverse previsioni sui contributi di geni non completamente caratterizzati ai processi cellulari fondamentali. Ad esempio, l'analisi del clustering fenotipico ha implicato C7orf26 come subunità del complesso dell'integratore principale, C1orf131 come regolatore della biogenesi del ribosoma e AKIRIN2 nella funzione del proteasoma. Hanno inoltre identificato geni knockout che portano a difetti nella funzione mitotica, compresi i ruoli inaspettati dei trasportatori legati alla membrana AQP7 e ATP1A1 e l'osmolarità cellulare nel promuovere un'accurata segregazione cromosomica.

Inoltre, questo articolo ha rivelato il ruolo di diversi regolatori dell'espressione genica nel controllo della divisione cellulare, tra cui il fattore di trascrizione previsto ZNF335, il complesso DREAM (LIN52), il complesso di elaborazione dell'mRNA a 30 estremità (CLP1) e lo spliceosoma più piccolo (RNPC3). l’espressione di specifici componenti della divisione cellulare. Questi esempi evidenziano il potere dello screening ottico per identificare i geni cofunzionali attraverso diversi percorsi biologici, con il potenziale per ulteriori scoperte dai dati qui pubblicati.

Conclusioni

I ricercatori hanno utilizzato in modo efficiente fenotipi complessi, multidimensionali e basati su immagini per ottenere cluster di geni funzionalmente rilevanti attraverso diversi processi cellulari su una scala molto più ampia di qualsiasi singolo screening di profilazione raggruppata basato su immagini. Di conseguenza, i ricercatori dispongono ora di una potente fonte di dati da esplorare e di un ambiente di test completo per sviluppare tecniche analitiche.

Due proteine ​​potrebbero agire in un unico percorso biologico senza mostrare un'interazione diretta. Oltre a identificare accuratamente i geni cofunzionali in una varietà di processi cellulari, il presente studio ha fornito un approccio ortogonale altamente scalabile per studi di interazione proteica a livello di proteoma. Inoltre, la profilazione fenotipica quantitativa basata su immagini ha definito in modo notevole cluster di geni per geni pan-essenziali, come. B. Componenti del ribosoma che non hanno requisiti diversi tra le linee cellulari. In molti casi, questa analisi ha anche identificato geni aggiuntivi e una risoluzione a grana più fine per i loro cluster genetici, consentendo la distinzione tra subunità ribosomiali centrali e fattori di biogenesi ribosomiale.

L'approccio dello studio ha avuto molto successo anche nell'identificare cluster di geni per processi morfologici, tra cui citocinesi, trasporto nucleare, condensazione cromosomica e altri, che altrimenti sarebbero difficili da identificare a causa dei cambiamenti trascrizionali. Ha inoltre generato dati di profilo complessi e l'identità di perturbazione per ciascuna cellula ha consentito la correlazione diretta di più fenotipi ad alta dimensione con perturbazioni individuali in un singolo esperimento. Nel complesso, gli schermi di profilazione CRISPR raggruppati e basati su immagini, relativamente economici, sono emersi come una solida strategia per definire le reti genetiche e i ruoli funzionali dei geni umani. Inoltre, gli schermi basati su immagini in pool erano relativamente facili da ridimensionare rispetto agli schermi basati su immagini in serie, con controlli misti che fornivano una solida base statistica per i confronti.

Riferimento:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

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