Zinātnieki identificē 5072 būtiskus cilvēka gēnus

Zinātnieki identificē 5072 būtiskus cilvēka gēnus

Pētījumā, kas nesen publicēts žurnālā šūna Pētnieki pētīja vairāku nenotveramu būtisku cilvēka gēnu fenotipisko ainavu, lai izveidotu detalizētu genotipa-fenotipa resursu, kas iezīmē šūnu fundamentālo procesu izjaukšanas fenotipiskās sekas.

Resurss: Būtisku cilvēka gēnu fenotipiskā ainava. Fotoattēlu kredīts: Billion Photos / Shutterstock

fons

Būtisku gēnu lomas noteikšana dažādos šūnu procesos, tostarp to ieguldījuma šūnu morfoloģijā vizualizēšana, ir ļoti svarīga, lai izprastu šūnu augšanas, proliferācijas un funkcionalitātes pamatus.

Par mācībām

Šajā pētījumā pētnieki vispirms veica grupētus regulāri starplaiku īsus palindromiskus atkārtojumus (CRISPR) — ar CRISPR saistīto proteīnu 9 (Cas9) balstītu funkcionālo skrīningu un identificēja 5072 fitnesa noteicošos būtiskos gēnus. Pēc tam viņi no esošajām sgRNS bibliotēkām atlasīja četras viena virzītāja ribonukleīnskābes (sgRNS) sekvences, kas bija vērstas uz katru gēnu, kā arī 250 “nemērķa” sgRNS.

Viņi piegādāja sgRNS bibliotēku HeLa šūnām, kas satur integrētu ar doksiciklīnu inducējamu Cas9 konstrukciju. Pēc tam viņi fiksēja šūnas un pastiprināja sgRNS sekvences in situ. Pēc tam viņi krāsoja un attēloja šūnas ar četrām krāsvielām, kas palīdzēja viņiem vizualizēt kodola morfoloģiju, dezoksiribonukleīnskābes (DNS) bojājumu reakciju, mikrotubulus un pavedienu aktīnu.

Pēc šūnu klasificēšanas kā starpfāzu vai mitotisku, komanda veica pakārtotās analīzes. Šī uz attēlu balstītā skrīnings nodrošināja mikroskopiskus attēlus, kas palīdzēja pētniekiem iegūt fenotipiskus mērījumus 1084 šūnu attēlveidošanas parametriem, tostarp intensitātes mērījumus, subcelulāro sadalījumu, punktu kolokalizāciju, kā arī šūnu un kodolu izmēru un formu. Pētnieki salīdzināja sgRNS identitāti vairāk nekā 31 miljonam šūnu ar vidēji 6119 šūnām uz vienu gēnu mērķi četrām sgRNS. Visbeidzot, pētnieki veica dzīvu šūnu apvienoto attēlveidošanu, lai identificētu gēnus, kas nepieciešami hromosomu segregācijai.

Studiju rezultāti

Apvienotā mikroskopiskā analīze vairāk nekā 31 miljonam atsevišķu izsitumu šūnu tūkstošiem piemērotību piešķirošu cilvēka gēnu identificēja īpašu ieguldījumu bioloģiskajos pamatprocesos, pamatojoties uz iegūtajiem šūnu fenotipiem. Šūnu parametri ir tieši salīdzināmi lielā šūnu populācijā un tiek saukti par gēna mērķa fenotipiskajiem “pirkstu nospiedumiem”. Salīdzinot šos fenotipiskos profilus, pētnieki definēja kofunkcionālas gēnu attiecības ar pietiekamu izšķirtspēju, lai atšķirtu saistītās lomas konkrētos šūnu procesos. Tomēr tikai četras šūnu krāsvielas bija pietiekamas, lai identificētu funkcionālās attiecības starp gēniem dažādos bioloģiskos ceļos, neanalizējot specifiskus šūnu marķierus, kas atbilst katram šūnu ceļam ar atšķirīgu funkciju.

Papildus izveidoto attiecību identificēšanai pašreizējais darbs sniedza vairākas prognozes par nepilnīgi raksturotu gēnu ieguldījumu fundamentālajos šūnu procesos. Piemēram, fenotipu klasterizācijas analīze iesaistīja C7orf26 kā kodola integratora kompleksa apakšvienību, C1orf131 kā ribosomu bioģenēzes regulatoru un AKIRIN2 proteasomu funkcijā. Viņi arī identificēja gēnu izsitumus, kas izraisa mitotiskās funkcijas defektus, tostarp ar membrānu saistīto transportētāju AQP7 un ATP1A1 negaidīto lomu un šūnu osmolaritāti, veicinot precīzu hromosomu segregāciju.

Turklāt šis raksts atklāja vairāku gēnu ekspresijas regulatoru lomu šūnu dalīšanās kontrolē, tostarp paredzamo transkripcijas faktoru ZNF335, DREAM kompleksu (LIN52), 30-end mRNS apstrādes kompleksu (CLP1) un mazāko spliceosomu (RNPC3). specifisku šūnu dalīšanās komponentu izpausme. Šie piemēri izceļ optiskās skrīninga spēku, lai identificētu kofunkcionālus gēnus dažādos bioloģiskos ceļos, un ir iespēja veikt turpmākus atklājumus no šeit publicētajiem datiem.

Secinājumi

Pētnieki efektīvi izmantoja sarežģītus, daudzdimensionālus, uz attēlu balstītus fenotipus, lai iegūtu funkcionāli nozīmīgas gēnu kopas dažādos šūnu procesos tādā mērogā, kas ir daudz lielāks nekā jebkurš viens uz attēlu balstīts apvienotais profilēšanas ekrāns. Tā rezultātā pētniekiem tagad ir spēcīgs datu avots, ko izpētīt, un visaptveroša testēšanas vide, lai izstrādātu analītiskos paņēmienus.

Divi proteīni varētu darboties vienā bioloģiskā ceļā, neuzrādot tiešu mijiedarbību. Papildus precīzai kofunkcionālu gēnu identificēšanai dažādos šūnu procesos, pašreizējais pētījums nodrošināja ļoti mērogojamu ortogonālu pieeju proteomu mēroga proteīnu mijiedarbības pētījumiem. Turklāt kvantitatīvā uz attēlu balstītā fenotipiskā profilēšana ievērojami definēja gēnu kopas būtiskiem gēniem, piemēram, . B. Ribosomu komponenti, kuriem nav atšķirīgas prasības šūnu līnijās. Daudzos gadījumos šī analīze identificēja arī papildu gēnus un to gēnu klasteru smalkāku izšķirtspēju, ļaujot atšķirt galvenās ribosomu apakšvienības un ribosomu bioģenēzes faktorus.

Pētījuma pieeja bija arī ļoti veiksmīga, nosakot gēnu kopas morfoloģiskiem procesiem, tostarp citokinēzei, kodoltransportam, hromosomu kondensācijai un citiem, kurus citādi būtu grūti identificēt transkripcijas izmaiņu dēļ. Tas arī ģenerēja sarežģītus profila datus, un katras šūnas perturbācijas identitāte ļāva vienā eksperimentā tiešu korelāciju starp vairākiem augstas dimensijas fenotipiem ar atsevišķiem traucējumiem. Kopumā salīdzinoši lēti, uz attēliem balstīti apvienotie CRISPR profilēšanas ekrāni ir kļuvuši par spēcīgu stratēģiju gēnu tīklu un cilvēka gēnu funkcionālo lomu noteikšanai. Turklāt apvienotos uz attēlu balstītos ekrānus bija salīdzinoši viegli mērogot, salīdzinot ar masīviem uz attēlu balstītiem ekrāniem, un jauktās vadīklas sniedza stabilu statistikas bāzi salīdzinājumiem.

Atsauce:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.