Wetenschappers identificeren 5.072 essentiële menselijke genen

Wetenschappers identificeren 5.072 essentiële menselijke genen

Dat blijkt uit een onderzoek dat onlangs in het tijdschrift is gepubliceerd cel Onderzoekers onderzochten het fenotypische landschap van verschillende ongrijpbare essentiële menselijke genen om een ​​gedetailleerde bron van genotype-fenotype te creëren die de fenotypische gevolgen schetst van het verstoren van fundamentele cellulaire processen.

Bron: Het fenotypische landschap van essentiële menselijke genen. Fotocredit: miljard foto's / Shutterstock

achtergrond

Het bepalen van de rol van essentiële genen in verschillende cellulaire processen, inclusief het visualiseren van hun bijdragen aan de celmorfologie, is cruciaal voor het begrijpen van de basis van celgroei, proliferatie en functionaliteit.

Over studeren

In de huidige studie voerden onderzoekers eerst Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) uit – CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9)-gebaseerde functionele screening en identificeerden 5.072 fitnessverlenende essentiële genen. Vervolgens selecteerden ze vier single-guide ribonucleïnezuur (sgRNA)-sequenties die zich op elk gen richtten, evenals 250 ‘niet-targeting’ sgRNA’s, uit bestaande sgRNA-bibliotheken.

Ze leverden de sgRNA-bibliotheek aan HeLa-cellen die een geïntegreerd, doxycycline-induceerbaar Cas9-construct bevatten. Vervolgens repareerden ze de cellen en amplificeerden ze de sgRNA-sequenties in situ. Vervolgens kleurden ze cellen en brachten ze in beeld met vier kleurstoffen die hen hielpen de nucleaire morfologie, de deoxyribonucleïnezuur (DNA) schadereactie, microtubuli en filamenteuze actine te visualiseren.

Nadat het team de cellen had geclassificeerd als interfase of mitotisch, voerde het team stroomafwaartse analyses uit. Deze op afbeeldingen gebaseerde screening leverde microscopische beelden op die onderzoekers hielpen fenotypische metingen te extraheren voor 1.084 celbeeldvormingsparameters, waaronder metingen van intensiteit, subcellulaire distributie, spot-colokalisatie en cel- en kerngrootte en -vorm. De onderzoekers vergeleken de sgRNA-identiteiten voor meer dan 31 miljoen cellen, met een mediaan van 6.119 cellen per gendoelwit voor vier sgRNA's. Ten slotte voerden de onderzoekers gepoolde beeldvorming van levende cellen uit om genen te identificeren die nodig zijn voor chromosoomsegregatie.

Studieresultaten

Gepoolde microscopische analyse van> 31 miljoen individuele knock-outcellen voor duizenden fitnessverlenende menselijke genen identificeerde specifieke bijdragen aan biologische kernprocessen op basis van de resulterende cellulaire fenotypes. Celparameters zijn direct vergelijkbaar binnen een grote celpopulatie en worden fenotypische ‘vingerafdrukken’ van een gendoelwit genoemd. Door deze fenotypische profielen te vergelijken, definieerden de onderzoekers cofunctionele genrelaties met voldoende resolutie om gerelateerde rollen in specifieke cellulaire processen te onderscheiden. Slechts vier cellulaire kleurstoffen waren echter voldoende om functionele relaties tussen genen over verschillende biologische routes te identificeren, zonder specifieke cellulaire markers te analyseren die overeenkomen met elke cellulaire route met een andere functie.

Naast het identificeren van gevestigde relaties, leverde het huidige werk verschillende voorspellingen op voor de bijdragen van onvolledig gekarakteriseerde genen aan fundamentele cellulaire processen. Fenotypeclusteringanalyse impliceerde bijvoorbeeld C7orf26 als een subeenheid van het kernintegratorcomplex, C1orf131 als regulator van ribosoombiogenese, en AKIRIN2 in de proteasoomfunctie. Ze identificeerden ook gen-knock-outs die leiden tot defecten in de mitotische functie, waaronder onverwachte rollen van de membraangebonden transporters AQP7 en ATP1A1 en cellulaire osmolariteit bij het bevorderen van nauwkeurige chromosoomsegregatie.

Bovendien onthulde dit artikel de rol van verschillende genexpressieregulatoren bij de controle van celdeling, waaronder de voorspelde transcriptiefactor ZNF335, het DREAM-complex (LIN52), het 30-uiteinden mRNA-verwerkingscomplex (CLP1) en het kleinere spliceosoom (RNPC3). de expressie van specifieke celdelingscomponenten. Deze voorbeelden benadrukken de kracht van optische screening om cofunctionele genen over verschillende biologische routes te identificeren, met het potentieel voor verdere ontdekkingen op basis van de hier gepubliceerde gegevens.

Conclusies

De onderzoekers gebruikten op efficiënte wijze complexe, multidimensionale, op afbeeldingen gebaseerde fenotypes om functioneel relevante genclusters over diverse cellulaire processen te verkrijgen op een schaal die veel groter is dan welk enkel op afbeeldingen gebaseerd gepoold profileringsscherm dan ook. Als gevolg hiervan hebben onderzoekers nu een krachtige gegevensbron om te verkennen en een uitgebreide testomgeving om analytische technieken te ontwikkelen.

Twee eiwitten zouden in één enkele biologische route kunnen werken zonder een directe interactie te vertonen. Naast het nauwkeurig identificeren van cofunctionele genen in een verscheidenheid aan cellulaire processen, bood de huidige studie een zeer schaalbare orthogonale benadering voor proteoombrede eiwitinteractiestudies. Bovendien heeft kwantitatieve, op afbeeldingen gebaseerde fenotypische profilering opmerkelijk gedefinieerde genclusters voor pan-essentiële genen, zoals. B. Ribosoomcomponenten die geen verschillende eisen stellen tussen cellijnen. In veel gevallen identificeerde deze analyse ook extra genen en een fijnmazigere resolutie voor hun genclusters, waardoor onderscheid kon worden gemaakt tussen kernribosoomsubeenheden en ribosoombiogenesefactoren.

De onderzoeksaanpak was ook zeer succesvol bij het identificeren van genclusters voor morfologische processen, waaronder cytokinese, nucleair transport, chromosoomcondensatie en andere, die anders moeilijk te identificeren zouden zijn vanwege transcriptionele veranderingen. Het genereerde ook complexe profielgegevens, en de verstoringsidentiteit voor elke cel maakte directe correlatie mogelijk van meerdere hoogdimensionale fenotypes met individuele verstoringen in één enkel experiment. Over het geheel genomen zijn relatief goedkope, op afbeeldingen gebaseerde gepoolde CRISPR-profileringsschermen naar voren gekomen als een robuuste strategie voor het definiëren van gennetwerken en de functionele rollen van menselijke genen. Bovendien waren gepoolde, op afbeeldingen gebaseerde schermen relatief eenvoudig te schalen in vergelijking met op arrays gebaseerde, op afbeeldingen gebaseerde schermen, waarbij gemengde bedieningselementen een robuuste statistische basis voor vergelijkingen boden.

Referentie:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.