Forskere identifiserer 5072 essensielle menneskelige gener

Forskere identifiserer 5072 essensielle menneskelige gener

I en studie nylig publisert i tidsskriftet celle Forskere undersøkte det fenotypiske landskapet til flere unnvikende essensielle menneskelige gener for å lage en detaljert genotype-fenotype-ressurs som skisserer de fenotypiske konsekvensene av å forstyrre grunnleggende cellulære prosesser.

Ressurs: Det fenotypiske landskapet av essensielle menneskelige gener. Bildekreditt: Billion Photos / Shutterstock

bakgrunn

Å bestemme rollen til essensielle gener i forskjellige cellulære prosesser, inkludert visualisering av deres bidrag til cellemorfologi, er avgjørende for å forstå grunnlaget for cellevekst, spredning og funksjonalitet.

Om å studere

I denne studien utførte forskerne først Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9)-basert funksjonell screening og identifiserte 5072 essensielle gener som gir trening. Deretter valgte de fire single-guide ribonukleinsyre (sgRNA) sekvenser som målrettet hvert gen, samt 250 "ikke-målrettede" sgRNA, fra eksisterende sgRNA biblioteker.

De leverte sgRNA-biblioteket til HeLa-celler som inneholdt en integrert doksycyklin-induserbar Cas9-konstruksjon. Deretter fikserte de cellene og amplifiserte sgRNA-sekvensene in situ. De farget og avbildet celler deretter med fire fargestoffer som hjalp dem med å visualisere kjernemorfologi, deoksyribonukleinsyre (DNA) skaderespons, mikrotubuli og filamentøst aktin.

Etter å ha klassifisert cellene som enten interfase eller mitotisk, utførte teamet nedstrømsanalyser. Denne bildebaserte screeningen ga mikroskopiske bilder som hjalp forskere med å trekke ut fenotypiske målinger for 1084 celleavbildningsparametere, inkludert målinger av intensitet, subcellulær distribusjon, flekkkolokalisering og celle- og kjernestørrelse og -form. Forskerne sammenlignet sgRNA-identiteter for over 31 millioner celler, med en median på 6119 celler per genmål for fire sgRNA-er. Til slutt utførte forskerne levende cellesamlet bildebehandling for å identifisere gener som kreves for kromosomsegregering.

Studieresultater

Samlet mikroskopisk analyse av >31 millioner individuelle knockout-celler for tusenvis av fitness-overførende menneskelige gener identifiserte spesifikke bidrag til biologiske kjerneprosesser basert på de resulterende cellulære fenotypene. Celleparametre er direkte sammenlignbare på tvers av en stor cellepopulasjon og refereres til som fenotypiske "fingeravtrykk" av et genmål. Ved å sammenligne disse fenotypiske profilene definerte forskerne kofunksjonelle genforhold med tilstrekkelig oppløsning til å skille beslektede roller i spesifikke cellulære prosesser. Imidlertid var bare fire cellulære fargestoffer tilstrekkelig til å identifisere funksjonelle forhold mellom gener på tvers av forskjellige biologiske veier, uten å analysere spesifikke cellulære markører som tilsvarer hver cellevei med en annen funksjon.

I tillegg til å identifisere etablerte relasjoner, ga det nåværende arbeidet flere spådommer for bidragene fra ufullstendig karakteriserte gener til grunnleggende cellulære prosesser. For eksempel impliserte fenotypeklyngeanalyse C7orf26 som en underenhet av kjerneintegratorkomplekset, C1orf131 som en regulator av ribosombiogenese og AKIRIN2 i proteasomfunksjon. De identifiserte også gen-knockouts som fører til defekter i mitotisk funksjon, inkludert uventede roller til de membranbundne transportørene AQP7 og ATP1A1 og cellulær osmolaritet for å fremme nøyaktig kromosomsegregering.

I tillegg avslørte denne artikkelen rollen til flere genekspresjonsregulatorer i kontrollen av celledeling, inkludert den predikerte transkripsjonsfaktoren ZNF335, DREAM-komplekset (LIN52), 30-endes mRNA-behandlingskomplekset (CLP1) og det mindre spleisosomet (RNPC3). uttrykket av spesifikke celledelingskomponenter. Disse eksemplene fremhever kraften til optisk screening for å identifisere kofunksjonelle gener på tvers av forskjellige biologiske veier, med potensialet for ytterligere oppdagelser fra dataene publisert her.

Konklusjoner

Forskerne brukte effektivt komplekse, flerdimensjonale, bildebaserte fenotyper for å oppnå funksjonelt relevante genklynger på tvers av forskjellige cellulære prosesser i en skala som er mye større enn noen enkelt bildebasert sammenslått profileringsskjerm. Som et resultat har forskere nå en kraftig datakilde å utforske og et omfattende testmiljø for å utvikle analytiske teknikker.

To proteiner kan virke i en enkelt biologisk vei uten å vise en direkte interaksjon. I tillegg til å nøyaktig identifisere kofunksjonelle gener på tvers av en rekke cellulære prosesser, ga den nåværende studien en svært skalerbar ortogonal tilnærming for proteomomfattende proteininteraksjonsstudier. Videre definerte kvantitativ bildebasert fenotypisk profilering bemerkelsesverdig definerte genklynger for pan-essensielle gener, som f.eks. B. Ribosomkomponenter som ikke har forskjellige krav på tvers av cellelinjer. I mange tilfeller identifiserte denne analysen også ytterligere gener og finkornet oppløsning for deres genklynger, noe som tillot skille mellom kjerneribosomunderenheter og ribosombiogenesefaktorer.

Studietilnærmingen var også svært vellykket med å identifisere genklynger for morfologiske prosesser, inkludert cytokinese, kjernetransport, kromosomkondensasjon og andre, som ellers ville være vanskelig å identifisere på grunn av transkripsjonelle endringer. Det genererte også komplekse profildata, og perturbasjonsidentiteten for hver celle muliggjorde direkte korrelasjon av flere høydimensjonale fenotyper med individuelle forstyrrelser i et enkelt eksperiment. Totalt sett har relativt rimelige, bildebaserte sammenslåtte CRISPR-profileringsskjermer dukket opp som en robust strategi for å definere gennettverk og de funksjonelle rollene til menneskelige gener. I tillegg var sammenslåtte bildebaserte skjermer relativt enkle å skalere sammenlignet med arrayerte bildebaserte skjermer, med blandede kontroller som ga et robust statistisk grunnlag for sammenligninger.

Referanse:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.