Naukowcy identyfikują 5072 niezbędne geny ludzkie

Naukowcy identyfikują 5072 niezbędne geny ludzkie

W badaniu opublikowanym niedawno w czasopiśmie komórka Naukowcy zbadali krajobraz fenotypowy kilku nieuchwytnych, niezbędnych genów ludzkich, aby stworzyć szczegółowe zasoby dotyczące genotypu i fenotypu, które nakreślają fenotypowe konsekwencje zakłócania podstawowych procesów komórkowych.

Ratunek: Fenotypowy krajobraz niezbędnych genów ludzkich. Źródło zdjęcia: miliard zdjęć / Shutterstock

tło

Określenie roli niezbędnych genów w różnych procesach komórkowych, w tym wizualizacja ich wkładu w morfologię komórki, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia podstaw wzrostu, proliferacji i funkcjonalności komórek.

O studiowaniu

W niniejszym badaniu naukowcy najpierw przeprowadzili funkcjonalne badania przesiewowe oparte na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – związanym z CRISPR białku 9 (Cas9) i zidentyfikowali 5072 niezbędnych genów zapewniających sprawność. Następnie wybrali cztery sekwencje kwasu rybonukleinowego o pojedynczym przewodniku (sgRNA), które nakierowują się na każdy gen, a także 250 „nieukierunkowanych” sgRNA z istniejących bibliotek sgRNA.

Dostarczyli bibliotekę sgRNA do komórek HeLa zawierających zintegrowany konstrukt Cas9 indukowany doksycykliną. Następnie utrwalili komórki i amplifikowali sekwencje sgRNA in situ. Następnie wybarwili i zobrazowali komórki czterema barwnikami, które pomogły im uwidocznić morfologię jądra, reakcję na uszkodzenie kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA), mikrotubule i aktynę nitkowatą.

Po sklasyfikowaniu komórek jako międzyfazowych lub mitotycznych zespół przeprowadził dalsze analizy. Dzięki temu badaniu przesiewowemu opartemu na obrazie uzyskano obrazy mikroskopowe, które pomogły naukowcom wyodrębnić pomiary fenotypowe dla 1084 parametrów obrazowania komórek, w tym pomiary intensywności, rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego, kolokalizacji plamek oraz wielkości i kształtu komórek i jąder. Naukowcy porównali tożsamość sgRNA dla ponad 31 milionów komórek, przy medianie 6119 komórek na docelowy gen dla czterech sgRNA. Na koniec badacze przeprowadzili obrazowanie puli żywych komórek, aby zidentyfikować geny wymagane do segregacji chromosomów.

Wyniki badań

Łączna analiza mikroskopowa ponad 31 milionów pojedynczych komórek z nokautem tysięcy ludzkich genów zapewniających sprawność pozwoliła zidentyfikować specyficzny wkład w podstawowe procesy biologiczne w oparciu o uzyskane fenotypy komórkowe. Parametry komórek są bezpośrednio porównywalne w dużej populacji komórek i określane są jako fenotypowe „odciski palców” docelowego genu. Porównując te profile fenotypowe, badacze zdefiniowali kofunkcjonalne powiązania genów z wystarczającą rozdzielczością, aby rozróżnić powiązane role w określonych procesach komórkowych. Jednak tylko cztery barwniki komórkowe były wystarczające do zidentyfikowania powiązań funkcjonalnych między genami w różnych szlakach biologicznych, bez analizowania specyficznych markerów komórkowych odpowiadających każdemu szlakowi komórkowemu o innej funkcji.

Oprócz zidentyfikowania ustalonych zależności, obecne prace dostarczyły kilku przewidywań dotyczących udziału nie w pełni scharakteryzowanych genów w podstawowych procesach komórkowych. Na przykład analiza grupowania fenotypów wykazała, że ​​C7orf26 jest podjednostką kompleksu rdzenia integratora, C1orf131 jako regulatorem biogenezy rybosomów i AKIRIN2 w funkcji proteasomu. Zidentyfikowali także nokauty genów prowadzące do defektów funkcji mitotycznych, w tym nieoczekiwaną rolę transporterów związanych z błoną AQP7 i ATP1A1 oraz osmolarność komórkową w promowaniu dokładnej segregacji chromosomów.

Ponadto w artykule ujawniono rolę kilku regulatorów ekspresji genów w kontroli podziału komórek, w tym przewidywany czynnik transkrypcyjny ZNF335, kompleks DREAM (LIN52), kompleks przetwarzający 30-końcowy mRNA (CLP1) i mniejszy spliceosom (RNPC3). ekspresja specyficznych składników podziału komórkowego. Przykłady te podkreślają skuteczność badań przesiewowych optycznych w identyfikowaniu genów kofunkcjonalnych na różnych szlakach biologicznych, co daje potencjał dalszych odkryć na podstawie opublikowanych tutaj danych.

Wnioski

Naukowcy skutecznie wykorzystali złożone, wielowymiarowe fenotypy oparte na obrazach, aby uzyskać funkcjonalnie istotne klastry genów w różnych procesach komórkowych w skali znacznie większej niż jakikolwiek pojedynczy ekran profilowania zbiorczego opartego na pojedynczym obrazie. W rezultacie badacze mają teraz potężne źródło danych do eksploracji i kompleksowe środowisko testowe do opracowywania technik analitycznych.

Dwa białka mogą działać na jednym szlaku biologicznym, nie wykazując bezpośredniej interakcji. Oprócz dokładnej identyfikacji genów kofunkcjonalnych w różnych procesach komórkowych, obecne badanie zapewniło wysoce skalowalne podejście ortogonalne do badań interakcji białek w całym proteomie. Co więcej, ilościowe profilowanie fenotypowe oparte na obrazie znacząco zdefiniowało klastry genów dla genów ogólnoistotnych, takich jak. B. Składniki rybosomów, które nie mają różnych wymagań w różnych liniach komórkowych. W wielu przypadkach analiza ta pozwoliła również zidentyfikować dodatkowe geny i uzyskać bardziej szczegółową rozdzielczość ich skupisk genów, co umożliwiło rozróżnienie między rdzeniowymi podjednostkami rybosomów a czynnikami biogenezy rybosomów.

Podejście badawcze okazało się również bardzo skuteczne w identyfikowaniu skupisk genów na potrzeby procesów morfologicznych, w tym cytokinezy, transportu jądrowego, kondensacji chromosomów i innych, które w innym przypadku byłyby trudne do zidentyfikowania ze względu na zmiany transkrypcyjne. Wygenerowano także złożone dane profilowe, a tożsamość zaburzeń dla każdej komórki umożliwiła bezpośrednią korelację wielu wielowymiarowych fenotypów z indywidualnymi zaburzeniami w jednym eksperymencie. Ogólnie rzecz biorąc, stosunkowo niedrogie, oparte na obrazach, zbiorcze ekrany profilowania CRISPR okazały się solidną strategią definiowania sieci genów i funkcjonalnych ról ludzkich genów. Ponadto ekrany oparte na zbiorczym obrazie były stosunkowo łatwe w skalowaniu w porównaniu z ekranami opartymi na matrycowym obrazie, a mieszane kontrole zapewniały solidną podstawę statystyczną do porównań.

Odniesienie:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.