Oamenii de știință identifică 5.072 de gene umane esențiale

Oamenii de știință identifică 5.072 de gene umane esențiale

Într-un studiu publicat recent în jurnal celulă Cercetătorii au examinat peisajul fenotipic al mai multor gene umane esențiale evazive pentru a crea o resursă detaliată genotip-fenotip care subliniază consecințele fenotipice ale perturbării proceselor celulare fundamentale.

Resursă: Peisajul fenotipic al genelor umane esențiale. Credit foto: Billion Photos / Shutterstock

fundal

Determinarea rolului genelor esențiale în diferite procese celulare, inclusiv vizualizarea contribuțiilor lor la morfologia celulară, este crucială pentru înțelegerea bazei creșterii, proliferării și funcționalității celulelor.

Despre studiu

În studiul de față, cercetătorii au efectuat mai întâi repetări palindromice scurte interspațiate în clustere (CRISPR) – screening funcțional bazat pe proteina 9 (Cas9) asociată cu CRISPR și au identificat 5.072 de gene esențiale care conferă fitness. Apoi, ei au selectat patru secvențe de acid ribonucleic cu ghid unic (sgRNA) care au vizat fiecare genă, precum și 250 de sgRNA „non-țintite”, din bibliotecile de sgRNA existente.

Ei au livrat biblioteca sgRNA celulelor HeLa care conțineau o construcție Cas9 inductabilă de doxiciclină integrată. Apoi, au fixat celulele și au amplificat secvențele sgRNA in situ. Apoi au colorat și au fotografiat celulele cu patru coloranți care i-au ajutat să vizualizeze morfologia nucleară, răspunsul la deteriorarea acidului dezoxiribonucleic (ADN), microtubuli și actina filamentoasă.

După ce a clasificat celulele ca fiind fie interfazice, fie mitotice, echipa a efectuat analize în aval. Acest screening bazat pe imagini a furnizat imagini microscopice care i-au ajutat pe cercetători să extragă măsurători fenotipice pentru 1.084 de parametri de imagistică celulară, inclusiv măsurători de intensitate, distribuție subcelulară, colocalizare spot și dimensiunea și forma celulelor și nucleilor. Cercetătorii au comparat identitățile sgRNA pentru peste 31 de milioane de celule, cu o medie de 6.119 celule pe genă țintă pentru patru sgRNA. În cele din urmă, cercetătorii au efectuat imagistica combinată cu celule vii pentru a identifica genele necesare pentru segregarea cromozomilor.

Rezultatele studiului

Analiza microscopică combinată a > 31 de milioane de celule knockout individuale pentru mii de gene umane care conferă fitness a identificat contribuții specifice la procesele biologice de bază pe baza fenotipurilor celulare rezultate. Parametrii celulari sunt direct comparabili într-o populație mare de celule și sunt denumiți „amprente” fenotipice ale unei gene țintă. Comparând aceste profiluri fenotipice, cercetătorii au definit relații de gene cofuncționale cu o rezoluție suficientă pentru a distinge rolurile înrudite în procesele celulare specifice. Cu toate acestea, doar patru coloranți celulari au fost suficiente pentru a identifica relațiile funcționale dintre gene pe diferite căi biologice, fără a analiza markeri celulari specifici corespunzători fiecărei căi celulare cu o funcție diferită.

Pe lângă identificarea relațiilor stabilite, lucrarea actuală a oferit mai multe predicții pentru contribuțiile genelor incomplet caracterizate la procesele celulare fundamentale. De exemplu, analiza grupării fenotipurilor a implicat C7orf26 ca o subunitate a complexului integrator central, C1orf131 ca regulator al biogenezei ribozomului și AKIRIN2 în funcția proteazomului. Ei au identificat, de asemenea, knockout-uri ale genelor care duc la defecte ale funcției mitotice, inclusiv roluri neașteptate ale transportatorilor legați de membrană AQP7 și ATP1A1 și osmolaritatea celulară în promovarea segregării precise a cromozomilor.

În plus, această lucrare a dezvăluit rolul mai multor regulatori ai expresiei genelor în controlul diviziunii celulare, inclusiv factorul de transcripție prezis ZNF335, complexul DREAM (LIN52), complexul de procesare a ARNm de 30 de capete (CLP1) și spliceosomeul mai mic (RNPC3). expresia componentelor specifice diviziunii celulare. Aceste exemple evidențiază puterea screening-ului optic de a identifica genele cofuncționale pe diverse căi biologice, cu potențialul pentru descoperiri ulterioare din datele publicate aici.

Concluzii

Cercetatorii au folosit eficient fenotipuri complexe, multidimensionale, bazate pe imagini pentru a obtine grupuri de gene relevante din punct de vedere functional in diverse procese celulare, la o scara mult mai mare decat orice ecran de profilare combinat bazat pe imagini. Drept urmare, cercetătorii au acum o sursă de date puternică de explorat și un mediu de testare cuprinzător pentru a dezvolta tehnici analitice.

Două proteine ​​ar putea acționa într-o singură cale biologică fără a prezenta o interacțiune directă. Pe lângă identificarea cu precizie a genelor cofuncționale într-o varietate de procese celulare, studiul actual a oferit o abordare ortogonală extrem de scalabilă pentru studiile de interacțiune a proteinelor la nivel de proteom. În plus, profilarea fenotipică cantitativă bazată pe imagini a definit în mod remarcabil grupurile de gene pentru gene pan-esențiale, cum ar fi. B. Componentele ribozomilor care nu au cerințe diferite pe liniile celulare. În multe cazuri, această analiză a identificat, de asemenea, gene suplimentare și rezoluția cu granulație mai fină pentru grupurile lor de gene, permițând distincția între subunitățile de bază ale ribozomului și factorii de biogeneză a ribozomului.

Abordarea studiului a avut, de asemenea, un mare succes în identificarea grupurilor de gene pentru procesele morfologice, inclusiv citokineza, transportul nuclear, condensarea cromozomilor și altele, care altfel ar fi dificil de identificat din cauza modificărilor transcripționale. De asemenea, a generat date complexe de profil, iar identitatea perturbației pentru fiecare celulă a permis corelarea directă a mai multor fenotipuri de dimensiuni înalte cu perturbații individuale într-un singur experiment. În general, ecranele de profilare CRISPR combinate, relativ ieftine, bazate pe imagini, au apărut ca o strategie robustă pentru definirea rețelelor de gene și a rolurilor funcționale ale genelor umane. În plus, ecranele bazate pe imagini combinate au fost relativ ușor de scalat în comparație cu ecranele bazate pe imagini în matrice, cu controale mixte oferind o bază statistică robustă pentru comparații.

Referinţă:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.