Vedci identifikujú 5 072 základných ľudských génov

Vedci identifikujú 5 072 základných ľudských génov

V štúdii nedávno publikovanej v časopise bunka Výskumníci skúmali fenotypovú krajinu niekoľkých nepolapiteľných základných ľudských génov, aby vytvorili podrobný zdroj genotypu a fenotypu, ktorý načrtáva fenotypové dôsledky narušenia základných bunkových procesov.

zdroj: Fenotypová krajina základných ľudských génov. Fotografický kredit: Billion Photos / Shutterstock

pozadia

Určenie úlohy esenciálnych génov v rôznych bunkových procesoch, vrátane vizualizácie ich príspevku k morfológii buniek, je kľúčové pre pochopenie základov bunkového rastu, proliferácie a funkčnosti.

O štúdiu

V tejto štúdii výskumníci najskôr vykonali klastrované pravidelné medzipriestorové krátke palindromické opakovania (CRISPR) – funkčný skríning na báze proteínu 9 (Cas9) spojeného s CRISPR a identifikovali 5 072 esenciálnych génov, ktoré udeľujú kondíciu. Ďalej vybrali štyri jednosmerné sekvencie ribonukleovej kyseliny (sgRNA), ktoré sa zameriavali na každý gén, ako aj 250 „necielených“ sgRNA z existujúcich knižníc sgRNA.

Dodali knižnicu sgRNA do buniek HeLa obsahujúcich integrovaný konštrukt Cas9 indukovateľný doxycyklínom. Ďalej fixovali bunky a amplifikovali sekvencie sgRNA in situ. Potom zafarbili a zobrazili bunky štyrmi farbivami, ktoré im pomohli vizualizovať jadrovú morfológiu, reakciu na poškodenie deoxyribonukleovou kyselinou (DNA), mikrotubuly a filamentózny aktín.

Po klasifikácii buniek buď ako medzifázové alebo mitotické, tím vykonal následné analýzy. Tento skríning založený na obrázkoch poskytol mikroskopické obrázky, ktoré pomohli výskumníkom extrahovať fenotypové merania pre 1 084 parametrov zobrazovania buniek, vrátane meraní intenzity, subcelulárnej distribúcie, bodovej kolokalizácie a veľkosti a tvaru buniek a jadier. Výskumníci porovnávali identity sgRNA pre viac ako 31 miliónov buniek, s mediánom 6 119 buniek na génový cieľ pre štyri sgRNA. Nakoniec výskumníci vykonali spoločné zobrazovanie živých buniek, aby identifikovali gény potrebné na segregáciu chromozómov.

Výsledky štúdie

Súhrnná mikroskopická analýza > 31 miliónov jednotlivých knockoutovaných buniek pre tisíce ľudských génov udeľujúcich kondíciu identifikovala špecifické príspevky k základným biologickým procesom na základe výsledných bunkových fenotypov. Bunkové parametre sú priamo porovnateľné v rámci veľkej bunkovej populácie a označujú sa ako fenotypové „odtlačky prstov“ génového cieľa. Porovnaním týchto fenotypových profilov výskumníci definovali kofunkčné génové vzťahy s dostatočným rozlíšením na rozlíšenie súvisiacich úloh v špecifických bunkových procesoch. Iba štyri bunkové farbivá však postačovali na identifikáciu funkčných vzťahov medzi génmi naprieč rôznymi biologickými dráhami bez analýzy špecifických bunkových markerov zodpovedajúcich každej bunkovej dráhe s odlišnou funkciou.

Okrem identifikácie zavedených vzťahov poskytla súčasná práca niekoľko predpovedí pre príspevky neúplne charakterizovaných génov k základným bunkovým procesom. Napríklad analýza zhlukovania fenotypov implikovala C7orf26 ako podjednotku komplexu jadrového integrátora, C1orf131 ako regulátor biogenézy ribozómov a AKIRIN2 vo funkcii proteazómu. Identifikovali tiež génové knockouty, ktoré vedú k defektom mitotickej funkcie, vrátane neočakávaných úloh membránovo viazaných transportérov AQP7 a ATP1A1 a bunkovej osmolarity pri podpore presnej segregácie chromozómov.

Okrem toho táto práca odhalila úlohu niekoľkých regulátorov génovej expresie pri kontrole bunkového delenia, vrátane predpovedaného transkripčného faktora ZNF335, komplexu DREAM (LIN52), komplexu na spracovanie mRNA s 30 koncami (CLP1) a menšieho spliceozómu (RNPC3). expresia špecifických komponentov bunkového delenia. Tieto príklady zdôrazňujú silu optického skríningu na identifikáciu kofunkčných génov naprieč rôznymi biologickými dráhami, s potenciálom pre ďalšie objavy z tu publikovaných údajov.

Závery

Výskumníci efektívne používali komplexné, viacrozmerné fenotypy založené na obrázkoch na získanie funkčne relevantných génových zhlukov naprieč rôznymi bunkovými procesmi v rozsahu oveľa väčšom ako akákoľvek jednotlivá združená profilovacia obrazovka založená na obrázkoch. Výsledkom je, že výskumníci majú teraz k dispozícii výkonný zdroj údajov na preskúmanie a komplexné testovacie prostredie na vývoj analytických techník.

Dva proteíny by mohli pôsobiť v jedinej biologickej dráhe bez toho, aby vykazovali priamu interakciu. Okrem presnej identifikácie kofunkčných génov v rôznych bunkových procesoch poskytla súčasná štúdia vysoko škálovateľný ortogonálny prístup pre štúdie interakcií proteínov v celom proteóme. Okrem toho, kvantitatívne fenotypové profilovanie založené na obraze pozoruhodne definovalo génové zhluky pre pan-esenciálne gény, ako napr. B. Ribozómové komponenty, ktoré nemajú rozdielne požiadavky v rámci bunkových línií. V mnohých prípadoch táto analýza tiež identifikovala ďalšie gény a jemnejšie rozlíšenie ich génových zhlukov, čo umožňuje rozlíšenie medzi podjednotkami jadrových ribozómov a faktormi biogenézy ribozómov.

Študijný prístup bol tiež veľmi úspešný pri identifikácii génových zhlukov pre morfologické procesy vrátane cytokinézy, nukleárneho transportu, kondenzácie chromozómov a iných, ktoré by inak bolo ťažké identifikovať v dôsledku transkripčných zmien. Vytvoril tiež komplexné profilové údaje a perturbačná identita pre každú bunku umožnila priamu koreláciu viacerých vysokorozmerných fenotypov s jednotlivými poruchami v jedinom experimente. Celkovo sa relatívne lacné združené CRISPR profilovacie obrazovky založené na obrázkoch ukázali ako robustná stratégia na definovanie génových sietí a funkčných úloh ľudských génov. Okrem toho sa združené obrazovky založené na obrázkoch dali pomerne ľahko škálovať v porovnaní s obrazovkami založenými na usporiadaných obrázkoch, pričom zmiešané kontroly poskytovali robustný štatistický základ pre porovnania.

Referencia:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.