Forskare identifierar 5 072 viktiga mänskliga gener

Forskare identifierar 5 072 viktiga mänskliga gener

I en studie som nyligen publicerats i tidskriften cell Forskare undersökte det fenotypiska landskapet av flera svårfångade essentiella mänskliga gener för att skapa en detaljerad genotyp-fenotyp resurs som beskriver de fenotypiska konsekvenserna av att störa grundläggande cellulära processer.

Resurs: Det fenotypiska landskapet av väsentliga mänskliga gener. Fotokredit: Billion Photos / Shutterstock

bakgrund

Att bestämma viktiga geners roll i olika cellulära processer, inklusive visualisering av deras bidrag till cellmorfologi, är avgörande för att förstå grunden för celltillväxt, proliferation och funktionalitet.

Om att studera

I den aktuella studien genomförde forskarna först Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) – CRISPR-associerad protein 9 (Cas9)-baserad funktionell screening och identifierade 5 072 konditionsgivande essentiella gener. Därefter valde de fyra single-guide ribonukleinsyra (sgRNA) sekvenser som riktade sig mot varje gen, såväl som 250 "icke-målinriktade" sgRNA, från befintliga sgRNA bibliotek.

De levererade sgRNA-biblioteket till HeLa-celler som innehöll en integrerad doxycyklin-inducerbar Cas9-konstruktion. Därefter fixerade de cellerna och amplifierade sgRNA-sekvenserna in situ. De färgade sedan och avbildade celler med fyra färgämnen som hjälpte dem att visualisera nukleär morfologi, deoxiribonukleinsyra (DNA) skadesvar, mikrotubuli och filamentöst aktin.

Efter att ha klassificerat cellerna som antingen interfas eller mitotisk, utförde teamet nedströmsanalyser. Denna bildbaserade screening gav mikroskopiska bilder som hjälpte forskare att extrahera fenotypiska mätningar för 1 084 cellavbildningsparametrar, inklusive mätningar av intensitet, subcellulär distribution, fläckkolokalisering och cell- och kärnans storlek och form. Forskarna jämförde sgRNA-identiteter för över 31 miljoner celler, med en median på 6 119 celler per genmål för fyra sgRNA. Slutligen utförde forskarna levande cellpoolad avbildning för att identifiera gener som krävs för kromosomsegregering.

Studieresultat

Poolad mikroskopisk analys av >31 miljoner individuella knockout-celler för tusentals konditionsgivande mänskliga gener identifierade specifika bidrag till biologiska kärnprocesser baserat på de resulterande cellulära fenotyperna. Cellparametrar är direkt jämförbara över en stor cellpopulation och hänvisas till som fenotypiska "fingeravtryck" av ett genmål. Genom att jämföra dessa fenotypiska profiler definierade forskarna samfunktionella genrelationer med tillräcklig upplösning för att särskilja relaterade roller i specifika cellulära processer. Men endast fyra cellulära färgämnen var tillräckliga för att identifiera funktionella relationer mellan gener över olika biologiska vägar, utan att analysera specifika cellulära markörer som motsvarar varje cellulär väg med en annan funktion.

Förutom att identifiera etablerade relationer gav det aktuella arbetet flera förutsägelser för bidragen från ofullständigt karakteriserade gener till grundläggande cellulära processer. Till exempel implicerade fenotypklusteranalys C7orf26 som en subenhet av kärnintegratorkomplexet, C1orf131 som en regulator av ribosombiogenes och AKIRIN2 i proteasomfunktion. De identifierade också genknockouts som leder till defekter i mitotisk funktion, inklusive oväntade roller för de membranbundna transportörerna AQP7 och ATP1A1 och cellulär osmolaritet för att främja korrekt kromosomsegregering.

Dessutom avslöjade detta dokument rollen för flera genuttrycksregulatorer i kontrollen av celldelning, inklusive den förutsagda transkriptionsfaktorn ZNF335, DREAM-komplexet (LIN52), 30-änds mRNA-bearbetningskomplexet (CLP1) och den mindre spliceosomen (RNPC3). uttrycket av specifika celldelningskomponenter. Dessa exempel belyser kraften hos optisk screening för att identifiera samfunktionella gener över olika biologiska vägar, med potential för ytterligare upptäckter från de data som publiceras här.

Slutsatser

Forskarna använde effektivt komplexa, multidimensionella, bildbaserade fenotyper för att erhålla funktionellt relevanta genkluster över olika cellulära processer i en skala som är mycket större än någon enskild bildbaserad poolad profilskärm. Som ett resultat har forskare nu en kraftfull datakälla att utforska och en omfattande testmiljö för att utveckla analytiska tekniker.

Två proteiner kan verka i en enda biologisk väg utan att visa en direkt interaktion. Förutom att exakt identifiera samfunktionella gener över en mängd olika cellulära processer, gav den aktuella studien en mycket skalbar ortogonal metod för proteomomfattande proteininteraktionsstudier. Vidare definierade kvantitativ bildbaserad fenotypisk profilering anmärkningsvärt genkluster för pan-essentiella gener, som t.ex. B. Ribosomkomponenter som inte har olika krav över cellinjer. I många fall identifierade denna analys också ytterligare gener och finare upplösning för deras genkluster, vilket möjliggör skillnad mellan kärnribosomsubenheter och ribosombiogenesfaktorer.

Studiemetoden var också mycket framgångsrik för att identifiera genkluster för morfologiska processer, inklusive cytokines, kärntransport, kromosomkondensering och andra, som annars skulle vara svåra att identifiera på grund av transkriptionsförändringar. Det genererade också komplexa profildata, och störningsidentiteten för varje cell möjliggjorde direkt korrelation av flera högdimensionella fenotyper med individuella störningar i ett enda experiment. Sammantaget har relativt billiga, bildbaserade poolade CRISPR-profileringsskärmar dykt upp som en robust strategi för att definiera gennätverk och mänskliga geners funktionella roller. Dessutom var poolade bildbaserade skärmar jämförelsevis lätta att skala jämfört med arraybildbaserade skärmar, med blandade kontroller som ger en robust statistisk grund för jämförelser.

Hänvisning:

• Die phänotypische Landschaft wesentlicher menschlicher Gene, Luke Funk, Kuan-Chung Su, Jimmy Ly, David Feldman, Avtar Singh, Brittania Moodie, Paul C.Blainey, Iain M.Cheeseman, Cell 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.017, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0092867422013599

.