Analýzy 11 komerčně dostupných PCR kitů pro detekci DNA viru opičích neštovic

Analýzy 11 komerčně dostupných PCR kitů pro detekci DNA viru opičích neštovic

V nedávné studii publikované v medRxiv * Server: Výzkumníci v Německu a Švýcarsku hodnotili 11 komerčních kitů pro reverzní transkripci polymerázové řetězové reakce (RT-PCR) (A až L) pro detekci viru opičích neštovic (MPXV).

Učit se: Vyhodnocení jedenácti komerčně dostupných PCR kitů pro detekci DNA viru opičích neštovic. Fotografický kredit: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Důležitá POZNÁMKA:medRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nejsou recenzovány odborníky, a proto by neměly být považovány za přesvědčivé, zamýšlené jako vodítko pro klinickou praxi/chování související se zdravím nebo s nimiž se zachází jako s ověřenými informacemi.

pozadí

Od května 2022 začaly celosvětově přibývat případy MPXV, zejména v Evropě a Spojených státech. Dříve byla tato nemoc endemická ve střední a západní Africe téměř 50 let. V důsledku toho byla epidemie MPXV v roce 2022 prohlášena 23. července 2022 za stav ohrožení veřejného zdraví mezinárodního významu.

Proto dostupnost RT-PCR souprav pro detekci orthopoxvirů (OPV), zejména MPXV, byla před rokem 2022 zanedbatelná. Specializované laboratoře se proto při diagnostice spoléhaly na interní protokoly. Testovací soupravy RT-PCR připravené k použití pro diagnostiku MPXV byly k dispozici teprve nedávno.

O studiu

V této studii výzkumníci hodnotili 11 připravených RT-PCR souprav pro diagnostiku MPXV pomocí referenčního diagnostického pracovního postupu Německé poradní laboratoře pro poxviry. Referenční panel 18 vzorků zahrnoval deoxyribonukleovou kyselinu (DNA) z MPXV kladu I, kladu IIa a kladu IIb, dalších OPV a viru varicella-zoster (VZV). Přesněji řečeno, existovala generická OPV PCR, MPXV-specifická PCR a MPXV klade II-specifická PCR.

Tyto soupravy analyzovaly všechny vzorky v duplikátech; Kromě toho tým přidal k těmto vzorkům kontrolu inhibice před extrakcí virové DNA. Tým zajistil správný odběr vzorků pomocí reakce RT-PCR specifické pro lidskou DNA.

Výzkumníci použili manuál výrobce ke spuštění těchto diagnostických souprav, všechny nastavené tak, aby získaly nejnižší možné hodnoty prahu cyklu (CT). Vědci navíc zajistili srovnatelnost všech 11 testovacích sad. Za tímto účelem spustili tyto soupravy na cykléru v reálném čase BioRad CFX 96, který je kompatibilní s fluorofory používanými v těchto testech.

Pro podrobnější charakterizaci testovacích souprav tým zaznamenal hodnoty CT pro každý vzorek DNA ve vztahu k počtu genomových ekvivalentů (GE), jak bylo stanoveno pomocí plazmidové standardní křivky. Nakonec zkoumali sklon křivky, který odráží účinnost RT-PCR, a Y-intercept, který ukazuje teoretickou minimální hodnotu CT získanou testem.

Výsledky studie

U izolátu MPXV třídy II 2012, s výjimkou soupravy F, všechny soupravy vykazovaly hodnoty CT v očekávaném rozsahu. Kromě toho vykazovaly dobrou analytickou citlivost s hodnotami CT 36, což odráží méně než pět GE na reakci. Při hodnotě CT 38, která odpovídá méně než jednomu GE na reakci a při nejnižším ředění, však dva kity a dvě generické referenční PCR pro OPV a MPXV nedokázaly detekovat oba vzorky. Na druhou stranu šest souprav mohlo detekovat pouze jeden ze dvou duplikátů; Tři soupravy a referenční RT-PCR specifická pro klad II detekovaly obě, což ukazuje na vysokou analytickou citlivost. Stojí za zmínku, že selhání duplikátu nemusí nutně odrážet špatný výkon testu.

Pro klad IIb tyto soupravy vykazovaly mírně lepší detekční rychlost u vzorků s vyššími hodnotami CT. Souprava L proto nemohla detekovat vzorky s hodnotami CT 38, zatímco většina souprav detekovala jeden replikát. Souprava K opět nedokázala detekovat replikát vzorku s hodnotou CT 32, zatímco tři soupravy nedokázaly detekovat ani replikát nejnižší koncentrace s hodnotou CT 35 proti kladu I MPXV. Tyto soupravy dosahovaly podobných hodnot CT pro většinu vzorků, zejména s ohledem na různé objemy vzorků použité na reakci. Mohlo to přispět k téměř dvěma až třem posunům hodnoty CT.

V některých testovacích příručkách byl limit detekce (LOD) vyjádřen v kopiích DNA/ml, což není optimální měření pro krusty a vzorky suchých výtěrů. Naštěstí všechny ovládací prvky obsažené v sadách fungovaly podle očekávání. Tyto testovací soupravy navíc fungovaly v rozsahu uvedeném v jejich příslušných příručkách.

Diplom

Celkově 11 souprav hodnocených v této studii prokázalo srovnatelnou a vysokou citlivost detekce pro DNA MPXV kladu I a II. Proto se tyto soupravy jevily jako vhodné pro stanovení klinicky relevantních zátěží MPXV DNA z řádně odebraných vzorků kožních lézí. V souladu s jejich zamýšleným účelem tyto soupravy prokázaly vynikající analytickou citlivost na MPXV nebo OPV a používaly vzorky s méně než přibližně pěti GE na reakci nebo hodnoty CT 36.

Výzkumníci poznamenali, že tyto soupravy a další, které vstupují do komerčního sektoru, jsou v současné době určeny pro výzkumné účely. Než je lze použít ke spolehlivé detekci MPXV v klinických vzorcích, je zapotřebí více údajů. Teprve potom by tyto sady podpořily komunity po celém světě s diagnostikou MPXV.

*Důležitá POZNÁMKA:medRxiv publikuje předběžné vědecké zprávy, které nejsou recenzovány odborníky, a proto by neměly být považovány za přesvědčivé, zamýšlené jako vodítko pro klinickou praxi/chování související se zdravím nebo s nimiž se zachází jako s ověřenými informacemi.

Odkaz:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.