Analyser af 11 kommercielt tilgængelige PCR-sæt til påvisning af abekoppevirus-DNA

Analyser af 11 kommercielt tilgængelige PCR-sæt til påvisning af abekoppevirus-DNA

I en nylig undersøgelse offentliggjort i medRxiv * Server: Forskere i Tyskland og Schweiz evaluerede 11 kommercielle revers transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) kits (A til L) til påvisning af monkeypox virus (MPXV).

Lære: Evaluering af elleve kommercielt tilgængelige PCR-sæt til påvisning af abekoppevirus-DNA. Fotokredit: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Vigtig BEMÆRK:medRxiv udgiver foreløbige videnskabelige rapporter, der ikke er peer-reviewed og derfor ikke bør betragtes som afgørende, beregnet til at vejlede klinisk praksis/sundhedsrelateret adfærd eller behandles som etableret information.

baggrund

Fra maj 2022 begyndte MPXV-sager at stige på verdensplan, især i Europa og USA. Tidligere var denne sygdom endemisk i Central- og Vestafrika i næsten 50 år. Som et resultat blev MPXV-udbruddet i 2022 erklæret som en folkesundhedsnødsituation af international bekymring den 23. juli 2022.

Derfor var tilgængeligheden af ​​RT-PCR-kits til påvisning af orthopoxvirus (OPV'er), især MPXV'er, ubetydelig før 2022. Derfor var specialiserede laboratorier afhængige af interne protokoller til diagnosticering. Brugsklare RT-PCR-testsæt til MPXV-diagnose er først for nylig blevet tilgængelige.

Om studiet

I denne undersøgelse evaluerede forskere 11 brugsklare RT-PCR-sæt til MPXV-diagnose ved hjælp af det tyske rådgivende laboratorium for poxvirus referencediagnostik. Referencepanelet med 18 prøver inkluderede deoxyribonukleinsyre (DNA) fra MPXV clade I, clade IIa og clade IIb, andre OPV'er og varicella-zoster-virus (VZV). Mere specifikt var der en generisk OPV PCR, en MPXV-specifik PCR og en MPXV clade II-specifik PCR.

Disse kits analyserede alle prøver i to eksemplarer; Derudover tilføjede holdet en hæmningskontrol til disse prøver, før det virale DNA blev ekstraheret. Holdet sikrede korrekt prøveudtagning ved hjælp af en human DNA-specifik RT-PCR-reaktion.

Forskerne brugte producentens manual til at køre disse diagnostiske kits, alle indstillet til at opnå de lavest mulige cyklustærskelværdier (CT). Derudover sikrede forskerne sammenligneligheden af ​​alle 11 testsæt. For at gøre dette kørte de disse kits på BioRad CFX 96 real-time cycler, som er kompatibel med fluoroforerne brugt i disse tests.

For mere detaljeret karakterisering af testkittene registrerede holdet CT-værdierne for hver DNA-prøve i forhold til antallet af genomækvivalenter (GE), som bestemt ved hjælp af en plasmidstandardkurve. Til sidst undersøgte de kurvens hældning, som afspejler RT-PCR-effektivitet, og Y-skæringspunktet, som angiver den teoretiske minimum CT-værdi opnået med et assay.

Studieresultater

For 2012 klasse II MPXV-isolatet, med undtagelse af kit F, viste alle kits CT-værdier i det forventede interval. Desuden viste de god analytisk følsomhed med CT-værdier på 36, hvilket afspejler mindre end fem GE pr. reaktion. Ved en CT-værdi på 38, hvilket svarer til mindre end én GE pr. reaktion og ved den laveste fortynding, kunne to kits og to generiske reference-PCR'er for OPV og MPXV imidlertid ikke påvise begge prøver. På den anden side kunne seks sæt kun detektere en af ​​de to dubletter; Tre kits og clade II-specifik reference RT-PCR detekterede begge, hvilket indikerer høj analytisk følsomhed. Det er værd at bemærke, at fejlen i en duplikat ikke nødvendigvis afspejler dårlig testydelse.

For clade IIb viste disse kits lidt bedre detektionshastigheder for prøver med højere CT-værdier. Derfor kunne Kit L ikke påvise prøver med CT-værdier på 38, mens de fleste kits påviste et enkelt replikat. Igen kunne kit K ikke detektere et replikat af en prøve med en CT-værdi på 32, mens tre kits ikke kunne påvise selv et replikat af den laveste koncentration med en CT-værdi på 35 mod clade I MPXV. Disse sæt opnåede lignende CT-værdier for de fleste prøver, især i betragtning af de forskellige prøvevolumener, der blev brugt pr. reaktion. Det kunne have bidraget til næsten to til tre CT-værdiforskydninger.

I nogle testmanualer blev detektionsgrænsen (LOD) udtrykt i DNA-kopier/ml, hvilket ikke er en optimal måling for skorper og tørre podningsprøver. Heldigvis fungerede alle kontroller inkluderet i sættene som forventet. Derudover udførte disse testsæt inden for det område, der er angivet i deres respektive manualer.

Eksamensbevis

Samlet set viste de 11 kits, der blev evalueret i den aktuelle undersøgelse, sammenlignelig og høj detektionsfølsomhed for MPXV clade I og II DNA'er. Derfor så disse kits ud til at være egnede til at bestemme klinisk relevante MPXV-DNA-belastninger fra korrekt udtagne hudlæsioner. I overensstemmelse med deres tilsigtede formål viste disse kits overlegen analytisk følsomhed over for MPXV eller OPV'er og brugte prøver med mindre end cirka fem GE pr. reaktion eller CT-værdier på 36.

Forskerne bemærkede, at disse kits og andre, der kommer ind i den kommercielle sektor, i øjeblikket er beregnet til forskningsformål. Der kræves flere data, før disse kan bruges til pålideligt at detektere MPXV i kliniske prøver. Først da ville disse sæt understøtte samfund rundt om i verden med MPXV-diagnose.

*Vigtig BEMÆRK:medRxiv udgiver foreløbige videnskabelige rapporter, der ikke er peer-reviewed og derfor ikke bør betragtes som afgørende, beregnet til at vejlede klinisk praksis/sundhedsrelateret adfærd eller behandles som etableret information.

Reference:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.