Analyysit 11 kaupallisesti saatavasta PCR-pakkauksesta apinapoxviruksen DNA:n havaitsemiseksi

Analyysit 11 kaupallisesti saatavasta PCR-pakkauksesta apinapoxviruksen DNA:n havaitsemiseksi

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa medRxiv * Palvelin: Saksan ja Sveitsin tutkijat arvioivat 11 kaupallista käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiosarjaa (RT-PCR) (A–L) apinapoxviruksen (MPXV) havaitsemiseksi.

Oppia: Yhdentoista kaupallisesti saatavan PCR-sarjan arviointi apinapoxviruksen DNA:n havaitsemiseksi. Kuva: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Tärkeä HUOMAUTUS:medRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pitäisi pitää ratkaisevina, tarkoitettujen kliinisten käytäntöjen/terveyteen liittyvän käyttäytymisen ohjaamiseen tai joita ei pitäisi käsitellä vakiintuneina tietoina.

tausta

Toukokuusta 2022 lähtien MPXV-tapaukset alkoivat lisääntyä maailmanlaajuisesti, erityisesti Euroopassa ja Yhdysvalloissa. Aikaisemmin tämä tauti oli endeeminen Keski- ja Länsi-Afrikassa lähes 50 vuoden ajan. Seurauksena on, että vuoden 2022 MPXV-epidemia julistettiin kansainvälisesti kiinnostavaksi kansanterveyden hätätilanteeksi 23. heinäkuuta 2022.

Siksi RT-PCR-pakkausten saatavuus orthopoxvirusten (OPV:iden), erityisesti MPXV:iden, havaitsemiseen oli mitätön ennen vuotta 2022. Siksi erikoistuneet laboratoriot luottivat diagnoosin tekemiseen talon sisäisiin protokolliin. Käyttövalmiit RT-PCR-testisarjat MPXV-diagnoosia varten ovat tulleet saataville vasta äskettäin.

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat arvioivat 11 käyttövalmis RT-PCR-sarjaa MPXV-diagnoosissa käyttämällä saksalaista poxvirusten neuvoa-antavaa laboratoriota. 18 näytteen vertailupaneeli sisälsi deoksiribonukleiinihapon (DNA) MPXV-kladista I, kladista IIa ja kladista IIb, muita OPV:itä ja varicella-zoster-virusta (VZV). Tarkemmin sanottuna oli geneerinen OPV PCR, MPXV-spesifinen PCR ja MPXV clade II -spesifinen PCR.

Nämä sarjat analysoivat kaikki näytteet kahtena kappaleena; Lisäksi ryhmä lisäsi estokontrollin näihin näytteisiin ennen virus-DNA:n uuttamista. Ryhmä varmisti oikean näytteenoton käyttämällä ihmisen DNA-spesifistä RT-PCR-reaktiota.

Tutkijat käyttivät valmistajan käsikirjaa suorittaakseen näitä diagnostiikkasarjoja, jotka kaikki oli asetettu saamaan mahdollisimman alhaisimman syklin kynnysarvot (CT). Lisäksi tutkijat varmistivat kaikkien 11 testisarjan vertailukelpoisuuden. Tätä varten he käyttivät näitä sarjoja BioRad CFX 96 -reaaliajassa, joka on yhteensopiva näissä testeissä käytettyjen fluoroforien kanssa.

Testipakkausten yksityiskohtaisempaa karakterisointia varten ryhmä kirjasi kunkin DNA-näytteen CT-arvot suhteessa genomiekvivalenttimäärään (GE), joka määritettiin käyttämällä plasmidin standardikäyrää. Lopuksi he tutkivat käyrän jyrkkyyttä, joka heijastaa RT-PCR:n tehokkuutta, ja Y-leikkauskohtaa, joka osoittaa määrityksellä saadun teoreettisen pienimmän CT-arvon.

Tutkimustulokset

Vuoden 2012 luokan II MPXV-isolaatilla, lukuun ottamatta sarjaa F, kaikki sarjat osoittivat CT-arvot odotetulla alueella. Lisäksi ne osoittivat hyvää analyyttistä herkkyyttä CT-arvoilla 36, ​​mikä heijastaa alle viittä GE:tä reaktiota kohden. Kuitenkin CT-arvolla 38, joka vastaa vähemmän kuin yhtä GE:tä reaktiota kohden ja pienimmällä laimennuksella, kaksi sarjaa ja kaksi yleistä referenssi-PCR:ää OPV:lle ja MPXV:lle eivät pystyneet havaitsemaan kumpaakaan näytettä. Toisaalta kuusi sarjaa pystyi havaitsemaan vain toisen kahdesta kaksoiskappaleesta; Kolme sarjaa ja clade II -spesifinen referenssi-RT-PCR havaitsi molemmat, mikä osoittaa suurta analyyttistä herkkyyttä. On syytä huomata, että kaksoiskappaleen epäonnistuminen ei välttämättä tarkoita huonoa testisuoritusta.

Kladilla IIb nämä sarjat osoittivat hieman parempia havaitsemisasteita näytteillä, joilla oli korkeammat CT-arvot. Siksi Kit L ei pystynyt havaitsemaan näytteitä, joiden CT-arvot olivat 38, kun taas useimmat sarjat havaitsivat yhden toiston. Taaskaan pakkaus K ei onnistunut havaitsemaan kopiota näytteestä, jonka CT-arvo oli 32, kun taas kolme pakkausta ei pystynyt havaitsemaan edes pienimmän pitoisuuden kopiota CT-arvolla 35 klade I MPXV:tä vastaan. Nämä sarjat saavuttivat samanlaiset CT-arvot useimmille näytteille, etenkin kun otetaan huomioon reaktiota kohden käytetyt erilaiset näytemäärät. Se on saattanut vaikuttaa lähes kahdesta kolmeen CT-arvon muutokseen.

Joissakin testausoppaissa havaitsemisraja (LOD) ilmaistiin DNA-kopioina/ml, mikä ei ole optimaalinen mitta kuorille ja kuiville vanupuikkonäytteille. Onneksi kaikki sarjojen ohjaimet toimivat odotetusti. Lisäksi nämä testisarjat suoritettiin vastaavissa käsikirjoissa määritellyllä alueella.

Diplomi

Kaiken kaikkiaan tässä tutkimuksessa arvioidut 11 sarjaa osoittivat vertailukelpoisen ja korkean havaitsemisherkkyyden MPXV-kladin I ja II DNA:ille. Siksi nämä sarjat näyttivät olevan sopivia kliinisesti merkityksellisten MPXV-DNA-kuormien määrittämiseen asianmukaisesti otetuista ihovaurioista. Tarkoituksensa mukaisesti nämä sarjat osoittivat ylivoimaista analyyttistä herkkyyttä MPXV:lle tai OPV:lle, ja niissä käytettiin näytteitä, joiden reaktio oli alle noin viisi GE-arvoa tai CT-arvot 36.

Tutkijat huomauttivat, että nämä ja muut kaupalliselle sektorille tulevat sarjat on tällä hetkellä tarkoitettu tutkimustarkoituksiin. Lisää tietoja tarvitaan, ennen kuin niitä voidaan käyttää MPXV:n luotettavaan havaitsemiseen kliinisistä näytteistä. Vasta sitten nämä sarjat tukisivat yhteisöjä ympäri maailmaa MPXV-diagnoosilla.

*Tärkeä HUOMAUTUS:medRxiv julkaisee alustavia tieteellisiä raportteja, joita ei ole vertaisarvioitu ja joita ei siksi pitäisi pitää ratkaisevina, tarkoitettujen kliinisten käytäntöjen/terveyteen liittyvän käyttäytymisen ohjaamiseen tai joita ei pitäisi käsitellä vakiintuneina tietoina.

Viite:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.