Analize 11 komercijalno dostupnih PCR kompleta za detekciju DNK virusa majmunskih boginja

Analize 11 komercijalno dostupnih PCR kompleta za detekciju DNK virusa majmunskih boginja

U nedavnoj studiji objavljenoj u medRxiv * Poslužitelj: Istraživači u Njemačkoj i Švicarskoj procijenili su 11 komercijalnih setova polimerazne lančane reakcije obrnute transkripcije (RT-PCR) (A do L) za detekciju virusa majmunskih boginja (MPXV).

Naučiti: Procjena jedanaest komercijalno dostupnih PCR kompleta za detekciju DNA virusa majmunskih boginja. Autor fotografije: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Važna NAPOMENA:medRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, namijenjena usmjeravanju kliničke prakse/ponašanja u vezi sa zdravljem ili tretirati kao utvrđene informacije.

pozadina

Od svibnja 2022. broj slučajeva MPXV-a počeo je rasti diljem svijeta, osobito u Europi i Sjedinjenim Državama. Prethodno je ova bolest bila endemična u srednjoj i zapadnoj Africi gotovo 50 godina. Kao rezultat toga, izbijanje MPXV 2022. proglašeno je javnozdravstvenim izvanrednim stanjem od međunarodnog značaja 23. srpnja 2022.

Stoga je dostupnost kompleta RT-PCR za otkrivanje ortopoksvirusa (OPV), posebice MPXV, bila zanemariva prije 2022. Stoga su se specijalizirani laboratoriji za dijagnozu oslanjali na interne protokole. Kompleti testova RT-PCR spremni za upotrebu za dijagnozu MPXV tek su nedavno postali dostupni.

O studiju

U ovoj studiji istraživači su procijenili 11 kompleta RT-PCR spremnih za upotrebu za dijagnozu MPXV-a koristeći referentni tijek dijagnostike njemačkog savjetodavnog laboratorija za poksviruse. Referentni panel od 18 uzoraka uključivao je deoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) iz MPXV klade I, klade IIa i klade IIb, druge OPV-ove i virus varicella-zoster (VZV). Točnije, postojao je generički OPV PCR, MPXV-specifični PCR i MPXV clade II-specifični PCR.

Ovi setovi analizirali su sve uzorke u duplikatu; Osim toga, tim je tim uzorcima dodao kontrolu inhibicije prije ekstrakcije virusne DNK. Tim je osigurao ispravno uzorkovanje pomoću RT-PCR reakcije specifične za ljudsku DNK.

Istraživači su koristili priručnik proizvođača za pokretanje ovih dijagnostičkih kompleta, koji su svi bili podešeni da dobiju najniže moguće vrijednosti praga ciklusa (CT). Osim toga, istraživači su osigurali usporedivost svih 11 testnih setova. Da bi to učinili, pokrenuli su ove komplete na BioRad CFX 96 cikleru u stvarnom vremenu, koji je kompatibilan s fluoroforima korištenim u ovim testovima.

Za detaljniju karakterizaciju testnih kompleta, tim je zabilježio CT vrijednosti za svaki uzorak DNK u odnosu na broj ekvivalenata genoma (GE), kako je određeno korištenjem standardne krivulje plazmida. Konačno, ispitali su nagib krivulje, koja odražava učinkovitost RT-PCR, i Y-odsječak, koji označava teoretsku minimalnu CT vrijednost dobivenu testom.

Rezultati studije

Za MPXV izolat klase II iz 2012., s izuzetkom kompleta F, svi setovi su pokazali CT vrijednosti u očekivanom rasponu. Nadalje, pokazali su dobru analitičku osjetljivost s CT vrijednostima od 36, odražavajući manje od pet GE po reakciji. Međutim, pri CT vrijednosti od 38, što odgovara manje od jednog GE po reakciji i pri najnižem razrjeđenju, dva kompleta i dva generička referentna PCR-a za OPV i MPXV nisu uspjela otkriti oba uzorka. S druge strane, šest kompleta moglo je otkriti samo jedan od dva duplikata; Tri kompleta i klade II specifična referentna RT-PCR otkrila su oba, što ukazuje na visoku analitičku osjetljivost. Vrijedno je napomenuti da neuspjeh duplikata ne odražava nužno lošu izvedbu testa.

Za kladu IIb, ovi setovi su pokazali nešto bolje stope detekcije za uzorke s višim CT vrijednostima. Stoga Kit L nije mogao detektirati uzorke s CT vrijednostima od 38, dok je većina kompleta detektirala jedno ponavljanje. Opet, komplet K nije uspio detektirati replikat uzorka s CT vrijednošću 32, dok tri kompleta nisu uspjela detektirati čak ni replikat najniže koncentracije s CT vrijednošću 35 u odnosu na klasu I MPXV. Ovi setovi postigli su slične CT vrijednosti za većinu uzoraka, posebno uzimajući u obzir različite volumene uzoraka korištene po reakciji. Moglo je pridonijeti gotovo dva do tri pomaka CT vrijednosti.

U nekim priručnicima za testiranje, granica detekcije (LOD) izražena je u kopijama DNK/mL, što nije optimalno mjerenje za kraste i suhe uzorke brisa. Srećom, sve kontrole uključene u setove radile su kako se očekivalo. Osim toga, ovi setovi za testiranje pokazali su rezultate unutar raspona navedenog u njihovim priručnicima.

Diploma

Sve u svemu, 11 kompleta procijenjenih u trenutnoj studiji pokazalo je usporedivu i visoku osjetljivost detekcije za MPXV klade I i II DNA. Stoga se čini da su ovi pribori prikladni za određivanje klinički relevantnih MPXV DNK opterećenja iz pravilno uzorkovanih kožnih lezija. U skladu s predviđenom svrhom, ovi setovi pokazali su superiornu analitičku osjetljivost na MPXV ili OPV i koristili su uzorke s manje od približno pet GE po reakciji ili CT vrijednostima od 36.

Istraživači su primijetili da su ti setovi i drugi koji ulaze u komercijalni sektor trenutno namijenjeni za istraživačke svrhe. Potrebno je više podataka prije nego što se mogu koristiti za pouzdano otkrivanje MPXV-a u kliničkim uzorcima. Tek tada bi ovi kompleti podržali zajednice diljem svijeta s MPXV dijagnozom.

*Važna NAPOMENA:medRxiv objavljuje preliminarna znanstvena izvješća koja nisu recenzirana i stoga se ne bi trebala smatrati uvjerljivima, namijenjena usmjeravanju kliničke prakse/ponašanja u vezi sa zdravljem ili tretirati kao utvrđene informacije.

Referenca:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.