11 komerciāli pieejamu PCR komplektu analīze pērtiķu baku vīrusa DNS noteikšanai

11 komerciāli pieejamu PCR komplektu analīze pērtiķu baku vīrusa DNS noteikšanai

Nesenā pētījumā, kas publicēts medRxiv * Serveris: pētnieki Vācijā un Šveicē novērtēja 11 komerciālus reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcijas (RT-PCR) komplektus (A līdz L), lai noteiktu pērtiķu baku vīrusu (MPXV).

Uzziniet: Vienpadsmit komerciāli pieejamu PCR komplektu novērtējums pērtiķu baku vīrusa DNS noteikšanai. Fotoattēlu kredīts: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Svarīga PIEZĪME:medRxiv publicē provizoriskus zinātniskus ziņojumus, kas nav salīdzinoši pārskatīti, un tāpēc tos nevajadzētu uzskatīt par pārliecinošiem, kas paredzēti klīniskās prakses/ar veselību saistītu uzvedību vadīšanai vai uzskatāmi par vispāratzītu informāciju.

fons

No 2022. gada maija MPXV gadījumu skaits sāka pieaugt visā pasaulē, īpaši Eiropā un Amerikas Savienotajās Valstīs. Iepriekš šī slimība gandrīz 50 gadus bija endēmiska Centrālajā un Rietumāfrikā. Tā rezultātā 2022. gada MPXV uzliesmojums 2022. gada 23. jūlijā tika pasludināts par starptautisku sabiedrības veselības ārkārtas situāciju.

Tāpēc RT-PCR komplektu pieejamība ortopoksvīrusu (OPV), īpaši MPXV, noteikšanai pirms 2022. gada bija niecīga. Tāpēc specializētās laboratorijas diagnozes noteikšanai paļāvās uz iekšējiem protokoliem. Tikai nesen kļuva pieejami lietošanai gatavi RT-PCR testa komplekti MPXV diagnostikai.

Par pētījumu

Šajā pētījumā pētnieki novērtēja 11 lietošanai gatavus RT-PCR komplektus MPXV diagnostikai, izmantojot Vācijas Poxviruses konsultatīvās laboratorijas atsauces diagnostikas darbplūsmu. 18 paraugu atsauces panelī bija iekļauta dezoksiribonukleīnskābe (DNS) no MPXV klades I, klades IIa un klades IIb, citi OPV un vējbaku-zoster vīruss (VZV). Konkrētāk, bija vispārējs OPV PCR, MPXV specifiskais PCR un MPXV II klades specifiskais PCR.

Šajos komplektos tika analizēti visi paraugi divos eksemplāros; Turklāt komanda pirms vīrusa DNS ekstrakcijas šiem paraugiem pievienoja inhibīcijas kontroli. Komanda nodrošināja pareizu paraugu ņemšanu, izmantojot cilvēka DNS specifisku RT-PCR reakciju.

Pētnieki izmantoja ražotāja rokasgrāmatu, lai palaistu šos diagnostikas komplektus, kas visi bija iestatīti, lai iegūtu zemākās iespējamās cikla sliekšņa (CT) vērtības. Turklāt pētnieki nodrošināja visu 11 testa komplektu salīdzināmību. Lai to izdarītu, viņi palaida šos komplektus ar BioRad CFX 96 reāllaika ciklu, kas ir saderīgs ar šajos testos izmantotajiem fluoroforiem.

Lai iegūtu sīkāku testu komplektu raksturojumu, komanda reģistrēja katra DNS parauga CT vērtības attiecībā pret genoma ekvivalentu skaitu (GE), kā noteikts, izmantojot plazmīdas standarta līkni. Visbeidzot, viņi pārbaudīja līknes slīpumu, kas atspoguļo RT-PCR efektivitāti, un Y-pārgriezumu, kas norāda teorētisko minimālo CT vērtību, kas iegūta ar testu.

Studiju rezultāti

2012. gada II klases MPXV izolātam, izņemot komplektu F, visi komplekti uzrādīja CT vērtības paredzētajā diapazonā. Turklāt tie uzrādīja labu analītisko jutību ar CT vērtībām 36, kas atspoguļo mazāk nekā piecus GE vienā reakcijā. Tomēr pie CT vērtības 38, kas atbilst mazākam par vienu GE vienā reakcijā un zemākajā atšķaidījumā, divi komplekti un divi vispārīgi atsauces PCR OPV un MPXV neizdevās noteikt abus paraugus. No otras puses, seši komplekti varēja noteikt tikai vienu no diviem dublikātiem; Trīs komplekti un II klades specifiskā atsauces RT-PCR atklāja abus, norādot uz augstu analītisko jutību. Ir vērts atzīmēt, ka dublikāta neveiksme ne vienmēr atspoguļo sliktu testa veiktspēju.

IIb kladei šie komplekti uzrādīja nedaudz labākus noteikšanas rādītājus paraugiem ar augstākām CT vērtībām. Tāpēc komplekts L nevarēja noteikt paraugus ar CT vērtībām 38, savukārt lielākā daļa komplektu atklāja vienu atkārtojumu. Atkal komplektam K neizdevās noteikt parauga replikātu ar CT vērtību 32, savukārt trīs komplekti nespēja noteikt pat zemākās koncentrācijas atkārtojumu ar CT vērtību 35 pret I klades MPXV. Šie komplekti sasniedza līdzīgas CT vērtības lielākajai daļai paraugu, īpaši ņemot vērā atšķirīgos parauga tilpumus, kas izmantoti vienā reakcijā. Tas varētu būt veicinājis gandrīz divas līdz trīs CT vērtības izmaiņas.

Dažās testēšanas rokasgrāmatās noteikšanas robeža (LOD) tika izteikta DNS kopijās/ml, kas nav optimāls garozas un sausu uztriepju paraugu mērījums. Par laimi, visas komplektā iekļautās vadības ierīces darbojās, kā paredzēts. Turklāt šie testa komplekti tika veikti attiecīgajās rokasgrāmatās norādītajā diapazonā.

Diploms

Kopumā pašreizējā pētījumā novērtētie 11 komplekti parādīja salīdzināmu un augstu noteikšanas jutību MPXV I un II klades DNS. Tāpēc šie komplekti izrādījās piemēroti, lai noteiktu klīniski nozīmīgu MPXV DNS slodzi no pareizi ņemtiem ādas bojājumiem. Atbilstoši paredzētajam mērķim šie komplekti uzrādīja augstāku analītisko jutību pret MPXV vai OPV un izmantoja paraugus ar mazāk nekā aptuveni pieciem GE vienā reakcijā vai CT vērtībām 36.

Pētnieki atzīmēja, ka šie komplekti un citi, kas nonāk komerciālajā sektorā, pašlaik ir paredzēti pētniecības nolūkiem. Ir nepieciešams vairāk datu, lai tos varētu izmantot, lai ticami noteiktu MPXV klīniskajos paraugos. Tikai tad šie komplekti atbalstītu kopienas visā pasaulē ar MPXV diagnostiku.

*Svarīga PIEZĪME:medRxiv publicē provizoriskus zinātniskus ziņojumus, kas nav salīdzinoši pārskatīti, un tāpēc tos nevajadzētu uzskatīt par pārliecinošiem, kas paredzēti klīniskās prakses/ar veselību saistītu uzvedību vadīšanai vai uzskatāmi par vispāratzītu informāciju.

Atsauce:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.