Analyses van 11 in de handel verkrijgbare PCR-kits voor de detectie van DNA van het apenpokkenvirus

Analyses van 11 in de handel verkrijgbare PCR-kits voor de detectie van DNA van het apenpokkenvirus

Uit een recente studie gepubliceerd in medRxiv * Server: Onderzoekers in Duitsland en Zwitserland evalueerden 11 commerciële kits voor reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) (A tot L) voor de detectie van het apenpokkenvirus (MPXV).

Leren: Evaluatie van elf in de handel verkrijgbare PCR-kits voor de detectie van DNA van het apenpokkenvirus. Fotocredit: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Belangrijke OPMERKING:medRxiv publiceert voorlopige wetenschappelijke rapporten die niet door vakgenoten zijn beoordeeld en daarom niet als doorslaggevend mogen worden beschouwd, niet bedoeld zijn als leidraad voor de klinische praktijk/gezondheidsgerelateerd gedrag, of moeten worden behandeld als gevestigde informatie.

achtergrond

Vanaf mei 2022 begonnen het aantal gevallen van MPXV wereldwijd toe te nemen, vooral in Europa en de Verenigde Staten. Voorheen was deze ziekte bijna 50 jaar endemisch in Centraal- en West-Afrika. Als gevolg hiervan werd de MPXV-uitbraak van 2022 op 23 juli 2022 uitgeroepen tot een noodsituatie op het gebied van de volksgezondheid van internationaal belang.

Daarom was de beschikbaarheid van RT-PCR-kits voor het detecteren van orthopoxvirussen (OPV’s), vooral MPXV’s, vóór 2022 verwaarloosbaar. Daarom vertrouwden gespecialiseerde laboratoria voor diagnose op interne protocollen. Kant-en-klare RT-PCR-testkits voor MPXV-diagnose zijn pas sinds kort beschikbaar.

Over de studie

In de huidige studie evalueerden onderzoekers 11 kant-en-klare RT-PCR-kits voor MPXV-diagnose met behulp van de referentiediagnostische workflow van het Duitse Advieslaboratorium voor Pokkenvirussen. Het referentiepanel met 18 monsters omvatte deoxyribonucleïnezuur (DNA) van MPXV clade I, clade IIa en clade IIb, andere OPV's en varicella-zoster-virus (VZV). Meer specifiek was er een generieke OPV-PCR, een MPXV-specifieke PCR en een MPXV clade II-specifieke PCR.

Deze kits analyseerden alle monsters in tweevoud; Bovendien voegde het team een ​​remmingscontrole aan deze monsters toe voordat het virale DNA werd geëxtraheerd. Het team zorgde voor een goede bemonstering met behulp van een menselijke DNA-specifieke RT-PCR-reactie.

De onderzoekers gebruikten de handleiding van de fabrikant om deze diagnostische kits uit te voeren, allemaal ingesteld om de laagst mogelijke cyclusdrempelwaarden (CT) te verkrijgen. Bovendien zorgden de onderzoekers ervoor dat alle elf testkits vergelijkbaar waren. Om dit te doen, hebben ze deze kits uitgevoerd op de BioRad CFX 96 real-time cycler, die compatibel is met de fluoroforen die in deze tests worden gebruikt.

Voor een meer gedetailleerde karakterisering van de testkits registreerde het team de CT-waarden voor elk DNA-monster in verhouding tot het aantal genoomequivalenten (GE), zoals bepaald met behulp van een plasmide-standaardcurve. Ten slotte onderzochten ze de helling van de curve, die de RT-PCR-efficiëntie weerspiegelt, en het Y-snijpunt, dat de theoretische minimale CT-waarde aangeeft die met een test is verkregen.

Studieresultaten

Voor het klasse II MPXV-isolaat uit 2012, met uitzondering van kit F, vertoonden alle kits CT-waarden in het verwachte bereik. Bovendien vertoonden ze een goede analytische gevoeligheid met CT-waarden van 36, wat neerkomt op minder dan vijf GE per reactie. Bij een CT-waarde van 38, wat overeenkomt met minder dan één GE per reactie en bij de laagste verdunning, slaagden twee kits en twee generieke referentie-PCR's voor OPV en MPXV er echter niet in beide monsters te detecteren. Aan de andere kant konden zes kits slechts één van de twee duplicaten detecteren; Drie kits en clade II-specifieke referentie-RT-PCR detecteerden beide, wat wijst op een hoge analytische gevoeligheid. Het is vermeldenswaard dat het mislukken van een duplicaat niet noodzakelijkerwijs een slechte testprestatie weerspiegelt.

Voor clade IIb vertoonden deze kits iets betere detectiepercentages voor monsters met hogere CT-waarden. Daarom kon Kit L geen monsters met CT-waarden van 38 detecteren, terwijl de meeste kits één replicaat detecteerden. Opnieuw slaagde kit K er niet in een replica van een monster met een CT-waarde van 32 te detecteren, terwijl drie kits er niet in slaagden zelfs een replica van de laagste concentratie met een CT-waarde van 35 tegen clade I MPXV te detecteren. Deze kits bereikten voor de meeste monsters vergelijkbare CT-waarden, vooral gezien de verschillende monstervolumes die per reactie werden gebruikt. Het zou kunnen hebben bijgedragen aan bijna twee tot drie CT-waardeverschuivingen.

In sommige testhandleidingen werd de detectielimiet (LOD) uitgedrukt in DNA-kopieën/ml, wat geen optimale maatstaf is voor korsten en droge uitstrijkjes. Gelukkig werkten alle bedieningselementen in de kits zoals verwacht. Bovendien presteerden deze testkits binnen het bereik dat is gespecificeerd in hun respectievelijke handleidingen.

Diploma

Over het geheel genomen vertoonden de 11 kits die in de huidige studie werden geëvalueerd een vergelijkbare en hoge detectiegevoeligheid voor MPXV clade I- en II-DNA's. Daarom leken deze kits geschikt te zijn voor het bepalen van klinisch relevante MPXV-DNA-ladingen uit correct bemonsterde huidlaesies. In overeenstemming met hun beoogde doel vertoonden deze kits een superieure analytische gevoeligheid voor MPXV of OPV's en gebruikten ze monsters met minder dan ongeveer vijf GE per reactie of CT-waarden van 36.

De onderzoekers merkten op dat deze en andere kits die in de commerciële sector terechtkomen momenteel bedoeld zijn voor onderzoeksdoeleinden. Er zijn meer gegevens nodig voordat deze kunnen worden gebruikt om op betrouwbare wijze MPXV in klinische monsters te detecteren. Alleen dan zouden deze kits gemeenschappen over de hele wereld ondersteunen met MPXV-diagnose.

*Belangrijke OPMERKING:medRxiv publiceert voorlopige wetenschappelijke rapporten die niet door vakgenoten zijn beoordeeld en daarom niet als doorslaggevend mogen worden beschouwd, niet bedoeld zijn als leidraad voor de klinische praktijk/gezondheidsgerelateerd gedrag, of moeten worden behandeld als gevestigde informatie.

Referentie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.