Analyser av 11 kommersielt tilgjengelige PCR-sett for påvisning av apekoppevirus-DNA

Analyser av 11 kommersielt tilgjengelige PCR-sett for påvisning av apekoppevirus-DNA

I en fersk studie publisert i medRxiv * Server: Forskere i Tyskland og Sveits evaluerte 11 kommersielle sett med revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) (A til L) for påvisning av apekoppevirus (MPXV).

Lære: Evaluering av elleve kommersielt tilgjengelige PCR-sett for påvisning av monkeypox virus DNA. Fotokreditt: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Viktig MERK:medRxiv publiserer foreløpige vitenskapelige rapporter som ikke er fagfellevurderte og derfor ikke bør anses som avgjørende, ment å veilede klinisk praksis/helserelatert atferd, eller behandles som etablert informasjon.

bakgrunn

Fra mai 2022 begynte MPXV-tilfeller å øke over hele verden, spesielt i Europa og USA. Tidligere var denne sykdommen endemisk i Sentral- og Vest-Afrika i nesten 50 år. Som et resultat ble MPXV-utbruddet i 2022 erklært som en folkehelsenødsituasjon av internasjonal bekymring 23. juli 2022.

Derfor var tilgjengeligheten av RT-PCR-sett for påvisning av ortopoksvirus (OPV), spesielt MPXV, ubetydelig før 2022. Derfor stolte spesialiserte laboratorier på interne protokoller for diagnose. Bruksklare RT-PCR-testsett for MPXV-diagnose har først nylig blitt tilgjengelig.

Om studiet

I denne studien evaluerte forskere 11 bruksklare RT-PCR-sett for MPXV-diagnose ved å bruke det tyske rådgivende laboratoriet for poxvirus referansediagnostisk arbeidsflyt. Referansepanelet med 18 prøver inkluderte deoksyribonukleinsyre (DNA) fra MPXV clade I, clade IIa og clade IIb, andre OPV-er og varicella-zoster-virus (VZV). Mer spesifikt var det en generisk OPV PCR, en MPXV-spesifikk PCR og en MPXV clade II-spesifikk PCR.

Disse settene analyserte alle prøver i duplikat; I tillegg la teamet en hemmingskontroll til disse prøvene før de ekstraherte virus-DNA. Teamet sørget for riktig prøvetaking ved hjelp av en human DNA-spesifikk RT-PCR-reaksjon.

Forskerne brukte produsentens håndbok for å kjøre disse diagnosesettene, alle satt til å oppnå lavest mulig syklusterskelverdier (CT). I tillegg sørget forskerne for sammenlignbarheten til alle 11 testsettene. For å gjøre dette, kjørte de disse settene på BioRad CFX 96 sanntidssyklus, som er kompatibel med fluoroforene som brukes i disse testene.

For mer detaljert karakterisering av testsettene, registrerte teamet CT-verdiene for hver DNA-prøve i forhold til antall genomekvivalenter (GE), bestemt ved bruk av en plasmidstandardkurve. Til slutt undersøkte de stigningstallet på kurven, som gjenspeiler RT-PCR-effektivitet, og Y-skjæringspunktet, som indikerer den teoretiske minimum CT-verdien oppnådd med en analyse.

Studieresultater

For 2012 klasse II MPXV-isolat, med unntak av sett F, viste alle sett CT-verdier i det forventede området. Videre viste de god analytisk sensitivitet med CT-verdier på 36, noe som reflekterte mindre enn fem GE per reaksjon. Ved en CT-verdi på 38, som tilsvarer mindre enn én GE per reaksjon og ved laveste fortynning, klarte imidlertid ikke to sett og to generiske referanse-PCR-er for OPV og MPXV å oppdage begge prøvene. På den annen side kunne seks sett bare oppdage én av de to duplikatene; Tre sett og clade II-spesifikk referanse RT-PCR oppdaget begge, noe som indikerer høy analytisk sensitivitet. Det er verdt å merke seg at feilen i et duplikat ikke nødvendigvis gjenspeiler dårlig testytelse.

For clade IIb viste disse settene litt bedre deteksjonshastigheter for prøver med høyere CT-verdier. Derfor kunne ikke Kit L oppdage prøver med CT-verdier på 38, mens de fleste sett påviste en enkelt replikat. Igjen klarte ikke kit K å detektere et replikat av en prøve med en CT-verdi på 32, mens tre sett ikke klarte å oppdage selv en replikat av den laveste konsentrasjonen med en CT-verdi på 35 mot clade I MPXV. Disse settene oppnådde lignende CT-verdier for de fleste prøvene, spesielt med tanke på de forskjellige prøvevolumene som ble brukt per reaksjon. Det kan ha bidratt til nesten to til tre CT-verdiskift.

I noen testmanualer ble deteksjonsgrensen (LOD) uttrykt i DNA-kopier/ml, noe som ikke er et optimalt mål for skorper og tørre vattpinneprøver. Heldigvis fungerte alle kontrollene som er inkludert i settene som forventet. I tillegg utførte disse testsettene innenfor området spesifisert i deres respektive manualer.

Diplom

Totalt sett viste de 11 settene som ble evaluert i den nåværende studien sammenlignbar og høy deteksjonssensitivitet for MPXV clade I og II DNA. Derfor så disse settene ut til å være egnet for å bestemme klinisk relevante MPXV-DNA-belastninger fra korrekt samplede hudlesjoner. I samsvar med det tiltenkte formålet viste disse settene overlegen analytisk følsomhet for MPXV eller OPV og brukte prøver med mindre enn omtrent fem GE per reaksjon eller CT-verdier på 36.

Forskerne bemerket at disse settene og andre som kommer inn i den kommersielle sektoren for tiden er beregnet på forskningsformål. Mer data kreves før disse kan brukes til pålitelig å oppdage MPXV i kliniske prøver. Først da ville disse settene støtte samfunn rundt om i verden med MPXV-diagnose.

*Viktig MERK:medRxiv publiserer foreløpige vitenskapelige rapporter som ikke er fagfellevurderte og derfor ikke bør anses som avgjørende, ment å veilede klinisk praksis/helserelatert atferd, eller behandles som etablert informasjon.

Referanse:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.