Analizy 11 dostępnych na rynku zestawów PCR do wykrywania DNA wirusa ospy małpiej

Analizy 11 dostępnych na rynku zestawów PCR do wykrywania DNA wirusa ospy małpiej

W niedawnym badaniu opublikowanym w medRxiv * Serwer: Naukowcy z Niemiec i Szwajcarii ocenili 11 komercyjnych zestawów do reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) (A do L) do wykrywania wirusa ospy małpiej (MPXV).

Uczyć się: Ocena jedenastu dostępnych na rynku zestawów PCR do wykrywania DNA wirusa ospy małpiej. Źródło zdjęcia: Salov Evgeniy / Shutterstock

*Ważna UWAGA:medRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dotyczące praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem ani traktowane jako ustalone informacje.

tło

Od maja 2022 r. liczba przypadków MPXV zaczęła rosnąć na całym świecie, szczególnie w Europie i Stanach Zjednoczonych. Wcześniej choroba ta występowała endemicznie w Afryce Środkowej i Zachodniej przez prawie 50 lat. W rezultacie 23 lipca 2022 r. epidemię MPXV w 2022 r. uznano za stan zagrożenia zdrowia publicznego o zasięgu międzynarodowym.

W związku z tym dostępność zestawów RT-PCR do wykrywania ortopokswirusów (OPV), zwłaszcza MPXV, przed 2022 r. była znikoma. Dlatego też wyspecjalizowane laboratoria w diagnostyce opierały się na wewnętrznych protokołach. Gotowe do użycia zestawy testów RT-PCR do diagnostyki MPXV stały się dostępne dopiero niedawno.

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy ocenili 11 gotowych do użycia zestawów RT-PCR do diagnostyki MPXV, korzystając z referencyjnego schematu postępowania diagnostycznego Niemieckiego Laboratorium Doradczego ds. wirusów ospy. Panel referencyjny składający się z 18 próbek obejmował kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) z kladu I, kladu IIa i kladu IIb MPXV, inne OPV i wirusa ospy wietrznej-półpaśca (VZV). Dokładniej, istniała ogólna PCR OPV, PCR specyficzna dla MPXV i PCR specyficzna dla kladu II MPXV.

Zestawy te analizowały wszystkie próbki w dwóch powtórzeniach; Dodatkowo zespół dodał do tych próbek kontrolę hamowania przed ekstrakcją wirusowego DNA. Zespół zapewnił prawidłowe pobieranie próbek za pomocą reakcji RT-PCR specyficznej dla ludzkiego DNA.

Badacze skorzystali z instrukcji producenta, aby uruchomić te zestawy diagnostyczne, wszystkie ustawione tak, aby uzyskać najniższe możliwe wartości progu cyklu (CT). Ponadto badacze zapewnili porównywalność wszystkich 11 zestawów testowych. W tym celu uruchomili te zestawy w cyklerze czasu rzeczywistego BioRad CFX 96, który jest kompatybilny z fluoroforami używanymi w tych testach.

W celu bardziej szczegółowej charakterystyki zestawów testowych zespół zanotował wartości CT dla każdej próbki DNA w odniesieniu do liczby równoważników genomu (GE), jak określono przy użyciu krzywej standardowej plazmidu. Na koniec zbadali nachylenie krzywej, które odzwierciedla skuteczność RT-PCR, oraz punkt przecięcia Y, który wskazuje teoretyczną minimalną wartość CT uzyskaną w teście.

Wyniki badań

Dla izolatu MPXV klasy II 2012, z wyjątkiem zestawu F, wszystkie zestawy wykazały wartości CT w oczekiwanym zakresie. Ponadto wykazały dobrą czułość analityczną z wartościami CT wynoszącymi 36, co odzwierciedla mniej niż pięć GE na reakcję. Jednakże przy wartości CT wynoszącej 38, co odpowiada mniej niż jednemu GE na reakcję i przy najniższym rozcieńczeniu, dwa zestawy i dwa ogólne referencyjne PCR dla OPV i MPXV nie pozwoliły wykryć obu próbek. Z drugiej strony sześć zestawów mogło wykryć tylko jeden z dwóch duplikatów; Obydwa wykryto za pomocą trzech zestawów i specyficznej dla kladu II referencyjnej metody RT-PCR, co wskazuje na wysoką czułość analityczną. Warto zauważyć, że niepowodzenie duplikatu niekoniecznie odzwierciedla słabą wydajność testu.

W przypadku kladu IIb zestawy te wykazały nieco lepsze współczynniki wykrywalności dla próbek o wyższych wartościach CT. Dlatego zestaw L nie mógł wykryć próbek o wartościach CT wynoszących 38, podczas gdy większość zestawów wykryła pojedynczą replikę. Ponownie zestaw K nie wykrył repliki próbki o wartości CT wynoszącej 32, podczas gdy trzy zestawy nie wykryły nawet repliki o najniższym stężeniu o wartości CT wynoszącej 35 względem kladu I MPXV. Zestawy te osiągnęły podobne wartości CT dla większości próbek, zwłaszcza biorąc pod uwagę różne objętości próbek stosowane w każdej reakcji. Mogło to przyczynić się do prawie dwóch do trzech przesunięć wartości przekładnika prądowego.

W niektórych podręcznikach testów granicę wykrywalności (LOD) wyrażono w kopiach DNA/ml, co nie jest optymalnym pomiarem w przypadku próbek ze strupów i suchych wymazów. Na szczęście wszystkie elementy sterujące zawarte w zestawach działały zgodnie z oczekiwaniami. Dodatkowo te zestawy testowe działały w zakresie określonym w odpowiednich instrukcjach.

Dyplom

Ogólnie rzecz biorąc, 11 zestawów ocenianych w bieżącym badaniu wykazało porównywalną i wysoką czułość wykrywania DNA kladu MPXV I i II. Dlatego też zestawy te okazały się odpowiednie do określenia klinicznie istotnego ładunku DNA MPXV z prawidłowo pobranych próbek zmian skórnych. Zgodnie z ich przeznaczeniem zestawy te wykazały doskonałą czułość analityczną na MPXV lub OPV i wykorzystywały próbki o mniej niż około pięciu GE na reakcję lub wartościach CT wynoszących 36.

Naukowcy zauważyli, że te zestawy i inne zestawy wprowadzane do sektora komercyjnego są obecnie przeznaczone do celów badawczych. Potrzebnych jest więcej danych, zanim będzie można je wykorzystać do niezawodnego wykrywania MPXV w próbkach klinicznych. Tylko wtedy te zestawy będą wspierać społeczności na całym świecie w diagnostyce MPXV.

*Ważna UWAGA:medRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie należy ich uważać za rozstrzygające, mające na celu wytyczne dotyczące praktyki klinicznej/zachowań związanych ze zdrowiem ani traktowane jako ustalone informacje.

Odniesienie:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.