Análises de 11 kits de PCR disponíveis comercialmente para detecção de DNA do vírus da varíola dos macacos

Análises de 11 kits de PCR disponíveis comercialmente para detecção de DNA do vírus da varíola dos macacos

Num estudo recente publicado em medRxiv * Servidor: Pesquisadores na Alemanha e na Suíça avaliaram 11 kits comerciais de reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) (A a L) para a detecção do vírus da varíola dos macacos (MPXV).

Aprender: Avaliação de onze kits de PCR disponíveis comercialmente para detecção de DNA do vírus da varíola dos macacos. Crédito da foto: Salov Evgeniy/Shutterstock

*NOTA IMPORTANTE:medRxiv publica relatórios científicos preliminares que não são revisados ​​por pares e, portanto, não devem ser considerados conclusivos, destinados a orientar a prática clínica/comportamento relacionado à saúde ou tratados como informações estabelecidas.

fundo

A partir de maio de 2022, os casos de MPXV começaram a aumentar em todo o mundo, especialmente na Europa e nos Estados Unidos. Anteriormente, esta doença era endémica na África Central e Ocidental durante quase 50 anos. Como resultado, o surto de MPXV de 2022 foi declarado uma emergência de saúde pública de interesse internacional em 23 de julho de 2022.

Portanto, a disponibilidade de kits de RT-PCR para detecção de ortopoxvírus (OPV), especialmente MPXV, era insignificante antes de 2022. Portanto, laboratórios especializados dependiam de protocolos internos para diagnóstico. Kits de teste RT-PCR prontos para uso para diagnóstico de MPXV só recentemente foram disponibilizados.

Sobre o estudo

No presente estudo, os pesquisadores avaliaram 11 kits de RT-PCR prontos para uso para diagnóstico de MPXV usando o fluxo de trabalho de diagnóstico de referência do Laboratório Consultivo Alemão para Poxvírus. O painel de referência de 18 amostras incluiu ácido desoxirribonucléico (DNA) do clado I, clade IIa e clade IIb do MPXV, outros OPVs e vírus varicela-zoster (VZV). Mais especificamente, houve uma PCR genérica de OPV, uma PCR específica para MPXV e uma PCR específica para MPXV do clade II.

Esses kits analisaram todas as amostras em duplicata; Além disso, a equipe adicionou um controle de inibição a essas amostras antes de extrair o DNA viral. A equipe garantiu a amostragem adequada usando uma reação RT-PCR específica do DNA humano.

Os pesquisadores usaram o manual do fabricante para executar esses kits de diagnóstico, todos configurados para obter os valores de limite de ciclo (CT) mais baixos possíveis. Além disso, os pesquisadores garantiram a comparabilidade de todos os 11 kits de teste. Para fazer isso, eles executaram esses kits no ciclador em tempo real BioRad CFX 96, que é compatível com os fluoróforos usados ​​nesses testes.

Para uma caracterização mais detalhada dos kits de teste, a equipe registrou os valores de CT para cada amostra de DNA em relação ao número de equivalentes de genoma (GE), conforme determinado por meio de uma curva padrão de plasmídeo. Finalmente, eles examinaram a inclinação da curva, que reflete a eficiência do RT-PCR, e a interceptação Y, que indica o valor mínimo teórico de CT obtido com um ensaio.

Resultados do estudo

Para o isolado MPXV classe II de 2012, com exceção do kit F, todos os kits apresentaram valores de CT dentro da faixa esperada. Além disso, apresentaram boa sensibilidade analítica com valores de CT de 36, refletindo menos de cinco GE por reação. No entanto, com um valor de CT de 38, que corresponde a menos de um GE por reação e na diluição mais baixa, dois kits e dois PCRs genéricos de referência para OPV e MPXV não conseguiram detectar ambas as amostras. Por outro lado, seis kits só conseguiram detectar uma das duas duplicatas; Três kits e RT-PCR de referência específico do clade II detectaram ambos, indicando alta sensibilidade analítica. Vale ressaltar que a falha de uma duplicata não reflete necessariamente um mau desempenho no teste.

Para o clade IIb, esses kits apresentaram taxas de detecção ligeiramente melhores para amostras com valores de CT mais elevados. Portanto, o Kit L não conseguiu detectar amostras com valores de CT de 38, enquanto a maioria dos kits detectou uma única réplica. Novamente, o kit K não conseguiu detectar uma réplica de uma amostra com um valor de CT de 32, enquanto três kits não conseguiram detectar nem mesmo uma réplica da concentração mais baixa com um valor de CT de 35 contra o clade I MPXV. Esses kits alcançaram valores de CT semelhantes para a maioria das amostras, especialmente considerando os diferentes volumes de amostra utilizados por reação. Pode ter contribuído para quase duas a três mudanças no valor do CT.

Em alguns manuais de teste, o limite de detecção (LOD) foi expresso em cópias de DNA/mL, o que não é uma medida ideal para amostras de crostas e esfregaços secos. Felizmente, todos os controles incluídos nos kits funcionaram conforme esperado. Além disso, esses kits de teste tiveram desempenho dentro da faixa especificada em seus respectivos manuais.

Diploma

No geral, os 11 kits avaliados no presente estudo demonstraram sensibilidade de detecção alta e comparável para DNAs dos clades I e II do MPXV. Portanto, esses kits pareciam ser adequados para determinar cargas de DNA de MPXV clinicamente relevantes a partir de amostras de lesões cutâneas adequadas. Consistente com a finalidade pretendida, esses kits demonstraram sensibilidade analítica superior a MPXV ou OPVs e usaram amostras com menos de aproximadamente cinco GE por reação ou valores de CT de 36.

Os investigadores observaram que estes kits e outros que entram no sector comercial são actualmente destinados a fins de investigação. Mais dados são necessários antes que estes possam ser usados ​​para detectar com segurança o MPXV em amostras clínicas. Só então estes kits apoiariam comunidades em todo o mundo com o diagnóstico de MPXV.

*NOTA IMPORTANTE:medRxiv publica relatórios científicos preliminares que não são revisados ​​por pares e, portanto, não devem ser considerados conclusivos, destinados a orientar a prática clínica/comportamento relacionado à saúde ou tratados como informações estabelecidas.

Referência:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

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