Analize a 11 truse PCR disponibile comercial pentru detectarea ADN-ului virusului variolei maimuței

Analize a 11 truse PCR disponibile comercial pentru detectarea ADN-ului virusului variolei maimuței

Într-un studiu recent publicat în medRxiv * Server: Cercetătorii din Germania și Elveția au evaluat 11 truse comerciale de reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR) (de la A la L) pentru detectarea virusului variolei maimuței (MPXV).

Învăţa: Evaluarea a unsprezece truse PCR disponibile comercial pentru detectarea ADN-ului virusului variolei maimuței. Credit foto: Salov Evgeniy / Shutterstock

*NOTA importanta:medRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu sunt revizuite de către colegi și, prin urmare, nu ar trebui să fie considerate concludente, menite să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

fundal

Din mai 2022, cazurile de MPXV au început să crească la nivel mondial, în special în Europa și Statele Unite. Anterior, această boală era endemică în Africa Centrală și de Vest timp de aproape 50 de ani. Ca urmare, focarul MPXV din 2022 a fost declarat o urgență de sănătate publică de interes internațional pe 23 iulie 2022.

Prin urmare, disponibilitatea truselor RT-PCR pentru detectarea ortopoxvirusurilor (OPV), în special MPXV, era neglijabilă înainte de 2022. Prin urmare, laboratoarele specializate s-au bazat pe protocoale interne pentru diagnostic. Trusele de testare RT-PCR gata de utilizare pentru diagnosticarea MPXV au devenit disponibile doar recent.

Despre studiu

În studiul de față, cercetătorii au evaluat 11 truse RT-PCR gata de utilizare pentru diagnosticarea MPXV, utilizând fluxul de lucru de diagnostic de referință al Laboratorului German de Consiliere pentru Poxviruses. Panoul de referință cu 18 eșantioane a inclus acid dezoxiribonucleic (ADN) de la MPXV clada I, clada IIa și clada IIb, alte OPV și virusul varicela-zoster (VZV). Mai precis, a existat o PCR OPV generică, o PCR specifică MPXV și o PCR specifică cladei II MPXV.

Aceste truse au analizat toate probele în duplicat; În plus, echipa a adăugat un control de inhibiție la aceste probe înainte de extragerea ADN-ului viral. Echipa a asigurat eșantionarea adecvată folosind o reacție RT-PCR specifică ADN-ului uman.

Cercetătorii au folosit manualul producătorului pentru a rula aceste truse de diagnosticare, toate pregătite pentru a obține cele mai mici valori posibile ale pragului de ciclu (CT). În plus, cercetătorii au asigurat comparabilitatea tuturor celor 11 truse de testare. Pentru a face acest lucru, au rulat aceste kituri pe ciclor-ul în timp real BioRad CFX 96, care este compatibil cu fluoroforii utilizați în aceste teste.

Pentru o caracterizare mai detaliată a truselor de testare, echipa a înregistrat valorile CT pentru fiecare probă de ADN în raport cu numărul de echivalenți ai genomului (GE), determinat folosind o curbă standard plasmidă. În cele din urmă, au examinat panta curbei, care reflectă eficiența RT-PCR, și interceptarea Y, care indică valoarea minimă teoretică CT obținută cu un test.

Rezultatele studiului

Pentru izolatul MPXV clasa II din 2012, cu excepția kit-ului F, toate kiturile au prezentat valori CT în intervalul așteptat. În plus, au arătat o sensibilitate analitică bună cu valori CT de 36, reflectând mai puțin de cinci GE per reacție. Cu toate acestea, la o valoare CT de 38, care corespunde la mai puțin de un GE per reacție și la cea mai mică diluție, două kituri și două PCR de referință generice pentru OPV și MPXV nu au reușit să detecteze ambele probe. Pe de altă parte, șase truse au putut detecta doar unul dintre cele două duplicate; Trei kituri și RT-PCR de referință specifice Cladei II le-au detectat pe ambele, indicând o sensibilitate analitică ridicată. Este de remarcat faptul că eșecul unui duplicat nu reflectă neapărat performanța slabă a testului.

Pentru clada IIb, aceste truse au arătat rate de detectare puțin mai bune pentru probele cu valori CT mai mari. Prin urmare, Kit L nu a putut detecta mostre cu valori CT de 38, în timp ce cele mai multe kituri au detectat o singură replicare. Din nou, kitul K nu a reușit să detecteze o reproducere a unei probe cu o valoare CT de 32, în timp ce trei kituri nu au reușit să detecteze nici măcar o reproducere a celei mai scăzute concentrații cu o valoare CT de 35 împotriva cladei I MPXV. Aceste truse au obținut valori CT similare pentru majoritatea probelor, mai ales având în vedere diferitele volume de eșantion utilizate pe reacție. S-ar putea să fi contribuit la aproape două până la trei modificări ale valorii CT.

În unele manuale de testare, limita de detecție (LOD) a fost exprimată în copii ADN/mL, ceea ce nu este o măsurătoare optimă pentru cruste și probe de tampon uscat. Din fericire, toate controalele incluse în kituri au funcționat conform așteptărilor. În plus, aceste kituri de testare au fost efectuate în intervalul specificat în manualele lor respective.

Diplomă

În general, cele 11 truse evaluate în studiul actual au demonstrat o sensibilitate de detecție comparabilă și ridicată pentru ADN-urile MPXV de clade I și II. Prin urmare, aceste truse au părut a fi potrivite pentru determinarea încărcăturilor de ADN MPXV relevante clinic din leziunile cutanate prelevate corespunzător. În concordanță cu scopul propus, aceste kituri au demonstrat o sensibilitate analitică superioară la MPXV sau OPV și au folosit probe cu mai puțin de aproximativ cinci GE per reacție sau valori CT de 36.

Cercetătorii au remarcat că aceste truse și altele care intră în sectorul comercial sunt destinate în prezent scopurilor de cercetare. Sunt necesare mai multe date înainte ca acestea să poată fi utilizate pentru a detecta în mod fiabil MPXV în probele clinice. Numai atunci aceste truse ar sprijini comunitățile din întreaga lume cu diagnosticul MPXV.

*NOTA importanta:medRxiv publică rapoarte științifice preliminare care nu sunt revizuite de către colegi și, prin urmare, nu ar trebui să fie considerate concludente, menite să ghideze practica clinică/comportamentul legat de sănătate sau tratate ca informații stabilite.

Referinţă:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Evaluierung von elf kommerziell erhältlichen PCR-Kits zum Nachweis von Monkeypox-Virus-DNA, Janine Michel, Angelina Targosz, Thomas Rinner, Daniel Bourquain, Annika Brinkmann, Jilian A. Sacks, Lars Schaade, Andreas Nitsche, medRxiv Pre-Print 2022, DOI: https://doi.org/10.1101/2022.10.14.22281096, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2022.10.14.22281096v1

.