Naukowcy opracowują nową metodę mapowania przestrzennego rozwoju nowotworu

Naukowcy opracowują nową metodę mapowania przestrzennego rozwoju nowotworu

W niedawno opublikowanym badaniu w Natura Naukowcy opracowali proces mapowania klonów genetycznych, który koncentruje się na technologii sekwencjonowania in situ specyficznego dla bazy (BaSISS) w celu uzyskania map ilościowych wielu klonów genetycznych komórek nowotworowych.

Lernen: Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab. Bildnachweis: Lightspring/Shutterstock

tło

Komórki nowotworowe lub nowotworowe to dynamiczne jednostki, które stale zmieniają i przekształcają swoje interakcje z mikrośrodowiskiem. Komórki te mają wiele populacji subklonalnych, które są genetycznie spokrewnionymi, ale odrębnymi grupami komórek.

Chociaż technologie genomiczne, takie jak sekwencjonowanie całego genomu (WGS), pozwoliły odkryć subklony, wydaje się, że nie są one w stanie rozszyfrować ich właściwości fenotypowych i interakcji w ekosystemach tkankowych. Jest to główne ograniczenie, ponieważ wszystkie cechy subklonów nowotworowych są wyznacznikami wzrostu, progresji, nawrotów lub niekorzystnych skutków nowotworu.

Przepływ pracy w systemie BasISS

Celem BaSISS były subklony zidentyfikowane na podstawie drzewa filogenetycznego pochodzącego z WGS. Sondy kłódkowe specyficzne dla mutacji BaSISS najpierw hybrydyzowały in situ z komplementarnym DNA (cDNA) z alleli zmutowanych i typu dzikiego wariantów somatycznych definiujących klony. Wszystkie w pełni ukierunkowane, uzupełniające sondy kłódkowe związały się i utworzyły zamknięte koła.

Następnie znakowane fluoroforem sondy przesłuchujące i mikroskopia cykliczna wykryły unikalne kody kreskowe czytnika o długości od czterech do pięciu nukleotydów z ligowanych sond, które amplifikowano poprzez amplifikację toczącego się koła, umożliwiając multipleksowanie. Zespół wykorzystał modelowanie matematyczne do stworzenia map klonów przy użyciu sygnałów BaSISS i genotypów klonów.

O studiowaniu

W niniejszym badaniu naukowcy pobrali osiem bloków tkanek od dwóch pacjentek (P1 i P2), które przeszły chirurgiczną mastektomię z powodu wieloogniskowego raka piersi. Te próbki tkanek obejmowały trzy stadia histologiczne wczesnej progresji nowotworu: rak przewodowy in situ (DCIS), rak inwazyjny i przerzuty do węzłów chłonnych.

Na trzech próbkach P1, P1-receptora estrogenowego (ER)1, P1-ER2 i P1-D1 eksperymenty WGS zidentyfikowały skupiska mutacji powiązane z sześcioma gałęziami drzew filogenetycznych. Sondy kłódkowe BaSISS celowały w 51 alleli na każdej gałęzi drzewa filogenetycznego. Zespół zidentyfikował subklon na podstawie identyfikatora pacjenta i koloru odpowiedniego węzła drzewa filogenetycznego.

W szczególności różne kolory oznaczone na P1 oznaczają węzeł. B. P1-fioletowy, P1-czerwony, P1-szary, P1-pomarańczowy, P1-zielony i P1-niebieski. Podobnie genotyp subklonu obejmował mutacje gałęzi, które kumulowały się w miarę przemieszczania się od korzenia drzewa do węzła subklonu. Na przykład zieleń P1 zawierała mutacje rozgałęziające szare, niebieskie i zielone.

Zespół zbadał trzy próbki pierwotnego raka piersi (PBC) o histologii mieszanej inwazyjnej i DCIS: potrójnie ujemne P1-ER1, P1-ER2 i P2 (TN)1, aby wykazać, że BaSISS może rejestrować ewolucję różnych stadiów raka w całych skrawkach tkanki. Ponadto badacze zintegrowali dane przestrzenne, aby określić, w jaki sposób zmiany fenotypowe są powiązane ze stanem genetycznym i zmianami stanu histologicznego.

Wiadomo, że DCIS jest genetycznie niejednorodny, ale sposób, w jaki klony DCIS organizują się i rosną w szerszym systemie kanałów, pozostaje niejasny. Dlatego zespół zbadał trzy próbki DCIS z P1 (P1-D1, P1-D2 i P1-D3), które obejmowały powierzchnię tkanki wynoszącą 224 mm2. Na koniec zespół przeprowadził przestrzenną analizę ekspresji genów za pomocą ukierunkowanego sekwencjonowania in situ (ISS).

Wyniki badań

E-Book Genetyka i genomika

Zestawienie najważniejszych wywiadów, artykułów i aktualności z ostatniego roku. Pobierz bezpłatną kopię

Prawie 97% wykrytych sygnałów punktowych BaSISS zostało przekonwertowanych na zrozumiałe kody kreskowe. Jego średni zasięg specyficzny dla celu był 13 000 razy większy na 300 mm2 tkanki piersi. Co więcej, wariantowe frakcje alleli pochodzące z BaSISS wykazały silne powiązanie w powtórzonych eksperymentach na seryjnych skrawkach tkanek, wykazując ich ilościową powtarzalność. Sygnały BaSISS pokolorowane zgodnie z gałęzią mutacji subklonalnej umożliwiły wizualny wgląd w strukturę wzrostu subklonalnego.

Algorytm mapowania klonów również dyskretnie dostosowywał obserwowane częstotliwości alleli pod kątem szeregu błędów systematycznych (np. różnej czułości sondy BaSISS). Jednakże częstości alleli modelowane za pomocą BaSISS były ściśle zgodne z danymi uzyskanymi za pomocą mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) i danymi walidacyjnymi WGS.

Zgodnie z masowymi danymi WGS, BaSISS wykrył od dwóch do czterech subklonów na PBC. Badanie ilościowe ujawniło, że poszczególne subklony tworzyły wzorce przestrzenne powiązane z histologicznym postępem chorób nowotworowych. Na przykład w P1-ER2 region z rozrostem nie był genetycznie powiązany z rakiem, co potwierdziło LCM-WGS. We wszystkich PBC modele progresji genetycznej i histologicznej były w dużej mierze stabilne. Rak inwazyjny składał się głównie z komórek z ostatnio rozdzielonego subklonu.

I odwrotnie, wcześniejsze rozbieżne klony całkowicie lub częściowo kolokalizowały z DCIS. Jednakże jeden subklon w każdym PBC obejmował zarówno histologię DCIS, jak i inwazyjną. Sugerowało to, że mogą również istnieć oddzielne etapy postępu histologicznego i genetycznego. Przykłady obejmują klon P1-czerwony w P1-ER1 i klon P1-fioletowy w P1-ER2.

Jeśli chodzi o zmiany fenotypowe związane z inwazją raka, badacze zaobserwowali, że regiony klonalne zmutowanych fosfatazy i homologu tensyny (PTEN) charakteryzowały się gęstszym barwieniem jądrowym Ki-67 metodą immunohistochemiczną (IHC) niż regiony typu dzikiego. Zwiększenie poziomu Ki-67, innego klonu genetycznego, było czasowo powiązane z nabyciem mutacji PTEN i poprzedziło inwazję.

Komórki nabłonka pomarańczy P1 wykazywały wyższą ekspresję onkogenów regulujących cykl komórkowy, cykliny D1 (CCND1) i cykliny B1 (CCNB1) oraz onkogenu białka palca cynkowego 3 (ZNF703), co wiązało się z niekorzystnymi wynikami klinicznymi. Ogólnie rzecz biorąc, wygląd architektoniczny i jądrowy oraz profile ekspresji genów były wyjątkowo specyficzne dla linii, a ich odrębne wzory można było również wizualizować przestrzennie.

Analiza próbki P2-LN1 za pomocą BaSISS ujawniła dwa klony (P2-niebieski i P2-pomarańczowy), które utworzyły przestrzennie oddzielne wzory. Adnotacja histologiczna z wykorzystaniem hematoksyliny i eozyny (H&E), wspólnego antygenu limfocytów (CD45) i barwienia pan-cytokeratyny pozwoliła zidentyfikować wiele wzorców wzrostu nowotworu z przerzutami. Autorzy odkryli silne powiązania między tymi dwoma odkrytymi klonami a ich histologicznymi wzorcami wzrostu.

Co więcej, odkryli, że specyficzne dla klonów wzorce ekspresji genów 17/91 zostały podsumowane w wielu, przestrzennie odrębnych obszarach na powierzchni ponad 1 cm2 tkanki nowotworowej. Ogólnie rzecz biorąc, klon BaSISS odwzorowuje powiązane przestrzennie zmiany genetyczne w mikrośrodowiskach dla poszczególnych klonów.

Wnioski

LCM, technika pobierania próbek pod kontrolą histologii, nie zapewnia obiektywnej reprezentacji obszarów subklonalnych raka, szczególnie w przypadku całych skrawków nowotworu. Z kolei w badaniu BaSISS zbadano przekroje tkanek o dużych centymetrach kwadratowych, co umożliwiło zbadanie całych przekrojów mniejszych guzów. Jest również stosunkowo niedrogi i nie opiera się wyłącznie na metodach opartych na WGS.

Podsumowując, BaSISS jest cennym dodatkiem do zestawu narzędzi omiki przestrzennej dzięki swojej niezwykłej zdolności do przestrzennej lokalizacji wielu odrębnych subklonów nowotworowych, a nawet charakteryzowania ich molekularnie. W przyszłości jego powszechne zastosowanie może pomóc w odkryciu, w jaki sposób nowotwór rozwija się w różnych tkankach, co z kolei może pomóc w wyśledzeniu niefortunnych subklonów powodujących niekorzystne wyniki kliniczne.

Odniesienie:

• Lomakin, A. et al. (2022) „Räumliche Genomik bildet die Struktur, Natur und Entwicklung von Krebsklonen ab“, Nature. doi: 10.1038/s41586-022-05425-2. https://www.nature.com/articles/s41586-022-05425-2

.