Συμπαγές κιτ ταχείας ανίχνευσης για δοκιμή για τον ιό της ευλογιάς των πιθήκων δείχνει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε νέα έρευνα

Συμπαγές κιτ ταχείας ανίχνευσης για δοκιμή για τον ιό της ευλογιάς των πιθήκων δείχνει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε νέα έρευνα

Σε πρόσφατο ρεπορτάζ στο περιοδικό Ταξιδιωτική ιατρική και μολυσματικές ασθένειες, οι ερευνητές εισήγαγαν ένα συμπαγές κιτ ταχείας ανίχνευσης που ελέγχει για ιούς της ευλογιάς των πιθήκων χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό ενίσχυσης πολυμεράσης ανασυνδυασμού (RPA) και τεχνολογίας ομαδοποιημένων τακτικά διακεκομμένων μικρών παλινδρομικών επαναλήψεων (CRISPR).

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

φόντο

Το ξέσπασμα της ευλογιάς των πιθήκων έχει εξαπλωθεί πολύ πέρα ​​από τις ενδημικές χώρες της Δυτικής και Κεντρικής Αφρικής το 2022 και ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (ΠΟΥ) την έχει πλέον κηρύξει έκτακτη ανάγκη για τη δημόσια υγεία διεθνούς ενδιαφέροντος. Το αιτιολογικό παθογόνο της ευλογιάς των πιθήκων είναι ο ιός της ευλογιάς των πιθήκων, ο οποίος ανήκει στο γένος των ορθοποξικών ιών.

Το τεστ που χρησιμοποιείται επί του παρόντος για την ανίχνευση της ευλογιάς των πιθήκων είναι το τεστ αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), το οποίο ενισχύει το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) του ιού ορθοποξιάς ή συγκεκριμένων ιών της ευλογιάς των πιθήκων. Ωστόσο, η PCR είναι μια χρονοβόρα διαδικασία που απαιτεί θερμικό κυκλωτή, εκπαιδευμένο προσωπικό και εργαστήριο.

Η έγκαιρη ανίχνευση και περιορισμός των μολυσμένων ατόμων είναι απαραίτητη για τον έλεγχο μιας εστίας ασθένειας. Οι ανοσοδοκιμασίες όπως οι ταινίες πλευρικής ροής είναι απλούστερες και ταχύτερες από τις PCR, αλλά έχουν υψηλότερη διασταυρούμενη αντιδραστικότητα για τους ιούς ορθοπόξου, καθιστώντας δύσκολη την ακριβή ανίχνευση της ευλογιάς των πιθήκων. Επομένως, η τεχνολογία που εντοπίζει γρήγορα την ευλογιά των πιθήκων και παρέχει ακριβή και αξιόπιστα αποτελέσματα είναι κρίσιμης σημασίας.

Μηχανισμός ανίχνευσης

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές ανέπτυξαν ένα κιτ ταχείας ανίχνευσης ή ένα εργαστήριο τσέπης για τον έλεγχο του ιού της ευλογιάς των πιθήκων. Το κιτ ανίχνευσης χρησιμοποιεί τις αρχές της τεχνολογίας RPA και CRISPR για να αυξήσει την ειδικότητα και την ευαισθησία της ανάλυσης. Το RPA ενισχύει τα γονίδια-στόχους του ιού της ευλογιάς των πιθήκων που σαρώνονται από το ριβονουκλεϊκό οξύ (RNA) οδηγό CRISPR και το ένζυμο πρωτεΐνη 12a (Cas12a) που σχετίζεται με το CRISPR.

Η διάσπαση της αλληλουχίας με τη μεσολάβηση CRISPR/Cas12sa συμβαίνει μόνο όταν αναγνωρίζονται τα αμπλικόνια στόχου της ευλογιάς των πιθήκων, εξαλείφοντας έτσι την πιθανότητα μη ειδικών σημάτων. Η διάσπαση οδηγεί σε φθορισμό, υποδεικνύοντας δείγματα θετικά στην ευλογιά των πιθήκων.

Εργαστήριο τσέπης

Το κιτ ζύγιζε 500 γραμμάρια και η θήκη ήταν αδιάβροχη και αρκετά συμπαγής ώστε να χωράει σε μια τσάντα. Τα εξαρτήματα αποτελούνταν από δύο τρισδιάστατα εκτυπωμένα θερμαντικά μπλοκ - το μπλοκ Α, το οποίο θερμαίνει τα δείγματα στους 80 °C για τη λύση του φακέλου του ιού και το μπλοκ Β, το οποίο θερμαίνει τα δείγματα στους 40 °C για ενίσχυση DNA.

Το κιτ περιελάμβανε σωλήνες που περιείχαν λυοφιλισμένα ένζυμα προστατευμένα με τρεαλόζη και σωλήνες δειγμάτων που περιείχαν διάλυμα χλωριούχου νατρίου και οξικού μαγνησίου. Ένα ρυθμιστικό διάλυμα επανυδάτωσης που περιέχει εκκινητές και τον ανταποκριτή φθορισμού καθώς και έναν φακό υπεριώδους (UV) για την ανίχνευση του φθορισμού συμπεριλήφθηκαν επίσης στο κιτ.

Κατά τη διαδικασία δοκιμής, το δείγμα τοποθετείται στο σωλήνα δείγματος και ο φάκελος του ιού λύεται χρησιμοποιώντας ένα θερμαντικό μπλοκ Α. Το θερμαινόμενο δείγμα προστίθεται στο σωλήνα που περιέχει τα λυοφιλοποιημένα ένζυμα και προστίθεται το ρυθμιστικό διάλυμα επανυδάτωσης. Στη συνέχεια, το θερμαντικό μπλοκ Β χρησιμοποιείται για την ενίσχυση της περιοχής στόχου. Τέλος, ο φθορισμός ανιχνεύεται με τον φακό UV.

Κατά τη διάρκεια της πειραματικής δοκιμής, οι ερευνητές διεξήγαγαν δείγματα ψευδοτυπικού ιού της ευλογιάς των πιθήκων, ο συνολικός χρόνος ήταν 25 λεπτά και δείγματα που περιείχαν μόνο δέκα σωματίδια ιού εντοπίστηκαν με ακρίβεια.

συμπεράσματα

Συμπερασματικά, οι ερευνητές παρουσίασαν ένα νέο κιτ ταχείας ανίχνευσης που ήταν συμπαγές και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων χωρίς τη χρήση πολύπλοκων οργάνων, εκπαιδευμένων τεχνικών ή εργαστηριακής εγκατάστασης.

Το κιτ ανίχνευσης χρησιμοποιεί τις αρχές των RPA και CRISPR για να ενισχύσει τις περιοχές-στόχους του DNA της ευλογιάς των πιθήκων και να τις διασπάσει χρησιμοποιώντας το σύμπλεγμα CRISPR/Cas12a, με έναν ανταποκριτή φθορισμού που σηματοδοτεί την ανίχνευση του DNA του ιού της ευλογιάς των πιθήκων.

Οι δοκιμές με τον ψευδότυπο ιό έδειξαν επιτυχή και ταχεία ανίχνευση του ιού της ευλογιάς των πιθήκων, υποδηλώνοντας ότι το κιτ θα μπορούσε ενδεχομένως να χρησιμοποιηθεί για γρήγορες δοκιμές ταξιδιωτών και σε περιοχές που δεν διαθέτουν επαρκή ιατρική υποδομή και εκπαιδευμένο προσωπικό.

Αναφορά:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.