Kompakti nopea tunnistussarja apinarokkoviruksen testaamiseen näyttää lupaavia tuloksia uudessa tutkimuksessa

Kompakti nopea tunnistussarja apinarokkoviruksen testaamiseen näyttää lupaavia tuloksia uudessa tutkimuksessa

Tuoreessa raportissa lehdessä Matkalääketiede ja tartuntataudit, tutkijat esittelivät kompaktin nopean havaitsemispakkauksen, joka testaa apinarokkoviruksia käyttämällä yhdistelmää rekombinaasipolymeraasin amplifikaatiosta (RPA) ja klusteroitua säännöllisesti väliin sijoitettua lyhyttä palindromitoistoa (CRISPR) -tekniikkaa.

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

tausta

Apinarokkoepidemia on levinnyt kauas Länsi- ja Keski-Afrikan endeemisten maiden ulkopuolelle vuonna 2022, ja Maailman terveysjärjestö (WHO) on nyt julistanut sen kansainvälisesti huolestuttavaksi kansanterveyshätätilanteeksi. Apinarokon etiologinen patogeeni on apinarokkovirus, joka kuuluu ortopoksivirusten sukuun.

Tällä hetkellä apinarokon havaitsemiseen käytetty testi on polymeraasiketjureaktio (PCR) -testi, joka monistaa ortopoksiviruksen tai spesifisten apinapoxvirusten deoksiribonukleiinihappoa (DNA). PCR on kuitenkin pitkä prosessi, joka vaatii lämpösyklilaitteen, koulutetun henkilöstön ja laboratorion.

Tartunnan saaneiden yksilöiden varhainen havaitseminen ja eristäminen on välttämätöntä taudinpurkauksen torjumiseksi. Immunomääritykset, kuten lateraalivirtausliuskat, ovat yksinkertaisempia ja nopeampia kuin PCR:t, mutta niillä on korkeampi ristireaktiivisuus ortopoksviruksille, mikä tekee tarkasta apinarokon havaitsemisesta vaikeaa. Siksi tekniikka, joka havaitsee apinarokon nopeasti ja tarjoaa tarkat ja luotettavat tulokset, on kriittinen.

Tunnistusmekanismi

Tässä tutkimuksessa tutkijat kehittivät nopean havaitsemispakkauksen tai taskulaboratorion apinapoxviruksen testaamiseksi. Havaintosarja käyttää RPA- ja CRISPR-teknologian periaatteita analyysin spesifisyyden ja herkkyyden lisäämiseksi. RPA monistaa apinapoxviruksen kohdegeenejä, jotka skannataan CRISPR:n ohjaavalla ribonukleiinihapolla (RNA) ja CRISPR:ään liittyvällä proteiini 12a (Cas12a) -entsyymillä.

CRISPR/Cas12sa-välitteinen sekvenssin katkaisu tapahtuu vain, kun apinapox-kohdeamplikonit tunnistetaan, mikä eliminoi epäspesifisten signaalien mahdollisuuden. Katkaisu johtaa fluoresenssiin, mikä osoittaa apinarokkopositiivisia näytteitä.

Taskulaboratorio

Sarja painoi 500 g ja kotelo oli vedenpitävä ja tarpeeksi kompakti mahtumaan pussiin. Komponentit koostuivat kahdesta kolmiulotteisesti painetusta kuumennuslohkosta – Block A, joka lämmittää näytteet 80 °C:seen viruskuoren hajoamista varten, ja Block B, joka lämmittää näytteet 40 °C:seen DNA-monistusta varten.

Pakkaus sisälsi trehaloosilla suojattuja lyofilisoituja entsyymejä sisältäviä putkia ja natriumkloridi- ja magnesiumasetaattiliuosta sisältäviä näyteputkia. Pakettiin sisältyi myös rehydraatiopuskuri, joka sisälsi alukkeita ja fluoresenssireportterin sekä ultravioletti (UV) taskulamppu fluoresenssin havaitsemiseksi.

Testausprosessin aikana näyte asetetaan näyteputkeen ja viruskuori lyysataan käyttämällä kuumennuslohkoa A. Kuumennettu näyte lisätään lyofilisoidut entsyymit sisältävään putkeen ja rehydraatiopuskuri lisätään. Lämmityslohkoa B käytetään sitten vahvistamaan kohdealuetta. Lopuksi fluoresenssi havaitaan UV-taskulamolla.

Kokeellisen testin aikana tutkijat suorittivat pseudotyyppisiä apinapox-virusnäytteitä, kokonaisaika oli 25 minuuttia, ja vain kymmenen viruspartikkelia sisältävät näytteet havaittiin tarkasti.

Johtopäätökset

Lopuksi tutkijat esittelivät uuden nopean havaitsemispakkauksen, joka oli kompakti ja jota voitaisiin käyttää apinarokkoviruksen havaitsemiseen ilman monimutkaisia ​​instrumentteja, koulutettuja teknikkoja tai laboratoriolaitteistoa.

Havaitsemispakkaus käyttää RPA:n ja CRISPR:n periaatteita apinapox-DNA:n kohdealueiden monistamiseen ja katkaisemiseen CRISPR/Cas12a-kompleksin avulla fluoresoivan reportterin kanssa, joka signaloi apinapoxviruksen DNA:n havaitsemisesta.

Pseudotyyppisellä viruksella tehdyt testit osoittivat apinapox-viruksen onnistuneen ja nopean havaitsemisen, mikä viittaa siihen, että pakkausta voitaisiin mahdollisesti käyttää matkailijoiden nopeaan testaukseen ja alueilla, joilla ei ole riittävää lääketieteellistä infrastruktuuria ja koulutettua henkilökuntaa.

Viite:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.