Kompaktiškas greito aptikimo rinkinys, skirtas beždžionių raupų viruso tyrimui, rodo daug žadančių naujų tyrimų rezultatų

Kompaktiškas greito aptikimo rinkinys, skirtas beždžionių raupų viruso tyrimui, rodo daug žadančių naujų tyrimų rezultatų

Naujausiame žurnalo pranešime Kelionių medicina ir infekcinės ligos, mokslininkai pristatė kompaktišką greito aptikimo rinkinį, kuriame tikrinami beždžionių raupų virusai, naudojant rekombinazės polimerazės amplifikacijos (RPA) ir reguliariai sugrupuotų trumpų palindrominių pakartojimų (CRISPR) technologiją.

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

fone

2022 m. beždžionių raupų protrūkis išplito toli už endeminių Vakarų ir Centrinės Afrikos šalių, o Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) dabar paskelbė, kad tai yra tarptautinio susirūpinimo visuomenės sveikatos ekstremali situacija. Etiologinis beždžionių raupų sukėlėjas yra beždžionių raupų virusas, priklausantis ortopokso virusų genčiai.

Šiuo metu beždžionių raupams aptikti naudojamas testas yra polimerazės grandininės reakcijos (PGR) testas, kuris sustiprina ortopokso viruso ar specifinių beždžionių raupų virusų dezoksiribonukleorūgštį (DNR). Tačiau PGR yra ilgas procesas, kuriam reikalingas terminis ciklas, apmokytas personalas ir laboratorija.

Norint suvaldyti ligos protrūkį, būtina anksti aptikti ir sulaikyti užsikrėtusius asmenis. Imunologiniai tyrimai, tokie kaip šoninės srauto juostelės, yra paprastesni ir greitesni nei PGR, tačiau turi didesnį kryžminį reaktyvumą ortopokso virusams, todėl sunku tiksliai nustatyti beždžionių raupų aptikimą. Todėl labai svarbi technologija, kuri greitai aptinka beždžionių raupus ir suteikia tikslius bei patikimus rezultatus.

Aptikimo mechanizmas

Šiame tyrime mokslininkai sukūrė greito aptikimo rinkinį arba kišeninę laboratoriją beždžionių raupų virusui tirti. Aptikimo rinkinyje naudojami RPA ir CRISPR technologijos principai, siekiant padidinti analizės specifiškumą ir jautrumą. RPA amplifikuoja beždžionių raupų viruso tikslinius genus, kuriuos nuskaito CRISPR vadovaujanti ribonukleino rūgštis (RNR) ir su CRISPR susijęs baltymas 12a (Cas12a).

CRISPR / Cas12sa tarpininkaujantis sekos skilimas įvyksta tik tada, kai atpažįstami beždžionių raupų tiksliniai amplikonai, todėl pašalinama nespecifinių signalų galimybė. Dėl skilimo atsiranda fluorescencija, o tai rodo, kad mėginiai yra teigiami beždžionių raupai.

Kišeninė laboratorija

Rinkinys svėrė 500 g, dėklas buvo atsparus vandeniui ir pakankamai kompaktiškas, kad tilptų į maišelį. Komponentus sudarė du trimačiai atspausdinti šildymo blokai – A blokas, kuris kaitina mėginius iki 80 °C viruso apvalkalo lizei, ir B blokas, kuris kaitina mėginius iki 40 °C DNR amplifikacijai.

Į rinkinį buvo įtraukti mėgintuvėliai su trehaloze apsaugotų liofilizuotų fermentų ir mėgintuvėliai su natrio chlorido ir magnio acetato tirpalu. Į rinkinį taip pat buvo įtrauktas rehidratacijos buferis, kuriame yra pradmenų ir fluorescencijos reporteris, taip pat ultravioletinis (UV) žibintuvėlis fluorescencijai aptikti.

Tyrimo metu mėginys įdedamas į mėgintuvėlį, o viruso apvalkalas lizuojamas naudojant šildymo bloką A. Pakaitintas mėginys įpilamas į mėgintuvėlį, kuriame yra liofilizuoti fermentai, ir įpilamas rehidratacijos buferis. Tada šildymo blokas B naudojamas tikslinei sričiai sustiprinti. Galiausiai fluorescencija aptinkama UV žibintuvėliu.

Eksperimentinio bandymo metu mokslininkai atliko pseudotipinius beždžionių raupų viruso mėginius, bendras laikas buvo 25 minutės, o mėginiai, kuriuose buvo tik dešimt viruso dalelių, buvo aptikti tiksliai.

Išvados

Apibendrinant, mokslininkai pristatė naują greito aptikimo rinkinį, kuris buvo kompaktiškas ir gali būti naudojamas beždžionių raupų virusui aptikti nenaudojant sudėtingų instrumentų, apmokytų technikų ar laboratorijos sąrankos.

Aptikimo rinkinys naudoja RPA ir CRISPR principus, kad amplifikuotų beždžionių raupų DNR tikslines sritis ir suskaidytų jas naudojant CRISPR/Cas12a kompleksą, o fluorescencinis reporteris signalizuoja apie beždžionių raupų viruso DNR aptikimą.

Bandymai su pseudotipiniu virusu parodė sėkmingą ir greitą beždžionių raupų viruso aptikimą, o tai rodo, kad rinkinys gali būti naudojamas greitiems keliautojų tyrimams ir vietovėse, kuriose trūksta tinkamos medicinos infrastruktūros ir apmokyto personalo.

Nuoroda:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.