Kompakts ātrās noteikšanas komplekts pērtiķu baku vīrusa testēšanai uzrāda daudzsološus rezultātus jaunos pētījumos

Kompakts ātrās noteikšanas komplekts pērtiķu baku vīrusa testēšanai uzrāda daudzsološus rezultātus jaunos pētījumos

Nesenajā žurnāla ziņojumā Ceļojumu medicīna un infekcijas slimības, pētnieki ieviesa kompaktu ātrās noteikšanas komplektu, kas pārbauda pērtiķu baku vīrusus, izmantojot rekombināzes polimerāzes amplifikācijas (RPA) un klasterizētu, regulāri izvietotu īsu palindromisku atkārtojumu (CRISPR) tehnoloģiju.

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

fons

2022. gadā pērtiķu baku uzliesmojums ir izplatījies tālu ārpus endēmiskajām Rietumāfrikas un Centrālāfrikas valstīm, un Pasaules Veselības organizācija (PVO) tagad to ir pasludinājusi par starptautisku sabiedrības veselības ārkārtas situāciju. Pērtiķu baku etioloģiskais patogēns ir pērtiķu baku vīruss, kas pieder pie ortopoksvīrusu ģints.

Pašlaik mērkaķbaku noteikšanai izmantotais tests ir polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) tests, kas pastiprina ortopoksvīrusa vai specifisku pērtiķu baku vīrusu dezoksiribonukleīnskābi (DNS). Tomēr PCR ir ilgstošs process, kam nepieciešams termiskais ciklists, apmācīts personāls un laboratorija.

Lai kontrolētu slimības uzliesmojumu, būtiska ir inficēto personu agrīna atklāšana un ierobežošana. Imūntesti, piemēram, sānu plūsmas sloksnes, ir vienkāršāki un ātrāki nekā PCR, taču tiem ir lielāka krusteniskā reaktivitāte pret ortopoksvīrusiem, kas apgrūtina precīzu pērtiķu baku noteikšanu. Tāpēc tehnoloģija, kas ātri nosaka pērtiķu bakas un nodrošina precīzus un uzticamus rezultātus, ir ļoti svarīga.

Atklāšanas mehānisms

Šajā pētījumā pētnieki izstrādāja ātrās noteikšanas komplektu vai kabatas laboratoriju pērtiķu baku vīrusa testēšanai. Noteikšanas komplekts izmanto RPA un CRISPR tehnoloģiju principus, lai palielinātu analīzes specifiskumu un jutīgumu. RPA pastiprina pērtiķu baku vīrusa mērķa gēnus, kurus skenē CRISPR vadošā ribonukleīnskābe (RNS) un ar CRISPR saistītais proteīna 12a (Cas12a) enzīms.

CRISPR/Cas12sa mediētā secības šķelšanās notiek tikai tad, kad tiek atpazīti mērkaķbaku mērķa amplikoni, tādējādi novēršot nespecifisku signālu iespējamību. Šķelšanās rezultātā rodas fluorescence, kas norāda uz pērtiķu baku pozitīviem paraugiem.

Kabatas laboratorija

Komplekts svēra 500 g, un korpuss bija ūdensizturīgs un pietiekami kompakts, lai ietilptu somā. Komponenti sastāvēja no diviem trīsdimensiju drukātiem sildīšanas blokiem – A bloka, kas uzsilda paraugus līdz 80 °C vīrusa apvalka līzei, un B bloka, kas uzsilda paraugus līdz 40 °C DNS amplifikācijai.

Komplektā bija mēģenes, kas satur ar trehalozi aizsargātus liofilizētus enzīmus, un paraugu mēģenes, kas satur nātrija hlorīda un magnija acetāta šķīdumu. Komplektā tika iekļauts arī rehidratācijas buferis, kas satur primerus un fluorescences reportieri, kā arī ultravioletais (UV) lukturītis fluorescences noteikšanai.

Testēšanas procesā paraugu ievieto parauga mēģenē un vīrusa apvalku lizē, izmantojot sildīšanas bloku A. Uzkarsēto paraugu pievieno mēģenei, kurā ir liofilizētie enzīmi, un pievieno rehidratācijas buferšķīdumu. Pēc tam sildīšanas bloks B tiek izmantots mērķa reģiona nostiprināšanai. Visbeidzot, fluorescence tiek noteikta ar UV lukturīti.

Eksperimentālā testa laikā pētnieki veica pseidotipizētus pērtiķu baku vīrusa paraugus, kopējais laiks bija 25 minūtes, un paraugi, kas satur tikai desmit vīrusa daļiņas, tika noteikti ar precizitāti.

Secinājumi

Noslēgumā pētnieki iepazīstināja ar jaunu ātrās noteikšanas komplektu, kas bija kompakts un ko varēja izmantot pērtiķu baku vīrusa noteikšanai, neizmantojot sarežģītus instrumentus, apmācītus tehniķus vai laboratorijas iestatījumus.

Noteikšanas komplekts izmanto RPA un CRISPR principus, lai pastiprinātu pērtiķu baku DNS mērķa reģionus un šķeltu tos, izmantojot CRISPR/Cas12a kompleksu, ar fluorescējošu reportieri, kas signalizē par pērtiķu baku vīrusa DNS noteikšanu.

Pārbaudes ar pseidotipa vīrusu liecināja par veiksmīgu un ātru pērtiķbaku vīrusa noteikšanu, kas liecina, ka komplektu varētu izmantot ceļotāju ātrai pārbaudei un apgabalos, kur trūkst atbilstošas ​​medicīniskās infrastruktūras un apmācīta personāla.

Atsauce:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.