Kompaktowy zestaw do szybkiego wykrywania do testowania wirusa ospy małp daje obiecujące wyniki w nowych badaniach

Kompaktowy zestaw do szybkiego wykrywania do testowania wirusa ospy małp daje obiecujące wyniki w nowych badaniach

W niedawnym raporcie w czasopiśmie Medycyna podróży i choroby zakaźne badacze wprowadzili kompaktowy zestaw do szybkiego wykrywania, który testuje wirusy ospy małpiej przy użyciu kombinacji amplifikacji polimerazy rekombinazy (RPA) i technologii krótkich, regularnie rozmieszczonych powtórzeń palindromowych (CRISPR).

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

tło

W 2022 r. epidemia ospy małpiej rozprzestrzeniła się daleko poza endemiczne kraje Afryki Zachodniej i Środkowej, a Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) ogłosiła obecnie, że stanowi zagrożenie dla zdrowia publicznego o zasięgu międzynarodowym. Patogenem etiologicznym ospy małpiej jest wirus ospy małpiej, który należy do rodzaju ortopokswirusów.

Testem obecnie stosowanym do wykrywania ospy małpiej jest test reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), który amplifikuje kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) wirusa ortopoksozy lub określonych wirusów ospy małpiej. Jednakże PCR jest długotrwałym procesem wymagającym termocyklera, przeszkolonego personelu i laboratorium.

Wczesne wykrycie i powstrzymanie zakażonych osób jest niezbędne do kontrolowania wybuchu choroby. Testy immunologiczne, takie jak paski z przepływem bocznym, są prostsze i szybsze niż PCR, ale mają wyższą reaktywność krzyżową w przypadku ortopokswirusów, co utrudnia dokładne wykrycie ospy małpiej. Dlatego technologia umożliwiająca szybkie wykrycie ospy małpiej i zapewniająca dokładne i wiarygodne wyniki ma kluczowe znaczenie.

Mechanizm wykrywania

W niniejszym badaniu naukowcy opracowali zestaw do szybkiego wykrywania lub kieszonkowe laboratorium do testowania wirusa ospy małpiej. Zestaw do detekcji wykorzystuje zasady technologii RPA i CRISPR w celu zwiększenia specyficzności i czułości analizy. RPA amplifikuje docelowe geny wirusa ospy małpiej, które są skanowane przez kwas rybonukleinowy (RNA) kierujący CRISPR i enzym białko 12a (Cas12a) związane z CRISPR.

Rozszczepienie sekwencji za pośrednictwem CRISPR/Cas12sa następuje tylko wtedy, gdy rozpoznane zostaną docelowe amplikony małpiej ospy, eliminując w ten sposób możliwość nieswoistych sygnałów. Rozszczepienie skutkuje fluorescencją, co wskazuje na próbki dodatnie pod względem ospy małpiej.

Laboratorium kieszonkowe

Zestaw ważył 500 g, a obudowa była wodoodporna i na tyle kompaktowa, że ​​zmieściła się w torbie. Elementy składały się z dwóch wydrukowanych trójwymiarowo bloków grzejnych – Bloku A, który podgrzewa próbki do 80°C w celu lizy otoczki wirusa, oraz Bloku B, który podgrzewa próbki do 40°C w celu amplifikacji DNA.

Zestaw zawierał probówki zawierające liofilizowane enzymy zabezpieczone trehalozą i probówki na próbki zawierające roztwory chlorku sodu i octanu magnezu. W zestawie znajdował się również bufor nawadniający zawierający startery i reporter fluorescencji, a także latarka ultrafioletowa (UV) do wykrywania fluorescencji.

Podczas procesu testowania próbkę umieszcza się w probówce na próbkę, a otoczkę wirusa poddaje się lizie za pomocą bloku grzejnego A. Ogrzaną próbkę dodaje się do probówki zawierającej liofilizowane enzymy i dodaje się bufor rehydratacyjny. Blok grzejny B jest następnie używany do wzmocnienia obszaru docelowego. Na koniec fluorescencję wykrywa się za pomocą latarki UV.

Podczas testu eksperymentalnego badacze przeprowadzili pseudotypowane próbki wirusa ospy małpiej. Całkowity czas trwania testu wynosił 25 minut, a próbki zawierające tylko dziesięć cząstek wirusa zostały wykryte z dokładnością.

Wnioski

Podsumowując, badacze zaprezentowali nowatorski zestaw do szybkiego wykrywania, który był kompaktowy i można go było wykorzystać do wykrycia wirusa ospy małpiej bez użycia skomplikowanych instrumentów, przeszkolonych techników czy konfiguracji laboratoryjnej.

Zestaw do wykrywania wykorzystuje zasady RPA i CRISPR do amplifikacji docelowych regionów DNA wirusa ospy małpiej i rozszczepiania ich przy użyciu kompleksu CRISPR/Cas12a z reporterem fluorescencyjnym sygnalizującym wykrycie DNA wirusa ospy małpiej.

Testy z użyciem pseudotypowanego wirusa wykazały skuteczne i szybkie wykrycie wirusa ospy małpiej, co sugeruje, że zestaw mógłby potencjalnie zostać wykorzystany do szybkiego testowania podróżnych oraz na obszarach, na których brakuje odpowiedniej infrastruktury medycznej i przeszkolonego personelu.

Odniesienie:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.