Kompaktná súprava na rýchlu detekciu na testovanie vírusu opičích kiahní vykazuje v novom výskume sľubné výsledky

Kompaktná súprava na rýchlu detekciu na testovanie vírusu opičích kiahní vykazuje v novom výskume sľubné výsledky

V nedávnej správe v časopise Cestovná medicína a infekčné choroby, výskumníci predstavili kompaktnú súpravu na rýchlu detekciu, ktorá testuje vírusy opičích kiahní pomocou kombinácie amplifikácie rekombinázovej polymerázy (RPA) a technológie klastrovaných pravidelne rozmiestnených krátkych palindromických opakovaní (CRISPR).

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

pozadia

Prepuknutie opičích kiahní sa v roku 2022 rozšírilo ďaleko za endemické krajiny západnej a strednej Afriky a Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) to teraz vyhlásila za stav verejného zdravia medzinárodného významu. Etiologickým patogénom opičích kiahní je vírus opičích kiahní, ktorý patrí do rodu ortopoxvírusov.

Test, ktorý sa v súčasnosti používa na detekciu opičích kiahní, je test polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorý zosilňuje deoxyribonukleovú kyselinu (DNA) ortopoxvírusu alebo špecifických vírusov opičích kiahní. PCR je však zdĺhavý proces, ktorý si vyžaduje termocyklér, vyškolený personál a laboratórium.

Včasná detekcia a kontrola infikovaných jedincov je nevyhnutná na kontrolu prepuknutia choroby. Imunotesty, ako sú prúžky s laterálnym prietokom, sú jednoduchšie a rýchlejšie ako PCR, ale majú vyššiu krížovú reaktivitu pre ortopoxvírusy, čo sťažuje presnú detekciu opičích kiahní. Preto je dôležitá technológia, ktorá rýchlo deteguje opičie kiahne a poskytuje presné a spoľahlivé výsledky.

Detekčný mechanizmus

V tejto štúdii výskumníci vyvinuli súpravu na rýchlu detekciu alebo vreckové laboratórium na testovanie vírusu opičích kiahní. Detekčná súprava využíva princípy technológie RPA a CRISPR na zvýšenie špecifickosti a citlivosti analýzy. RPA amplifikuje cieľové gény vírusu opičích kiahní, ktoré sú skenované CRISPR vodiacou ribonukleovou kyselinou (RNA) a CRISPR-asociovaným proteínom 12a (Cas12a).

CRISPR/Cas12sa-sprostredkované štiepenie sekvencie nastáva iba vtedy, keď sú rozpoznané cieľové amplikóny opičích kiahní, čím sa eliminuje možnosť nešpecifických signálov. Štiepenie má za následok fluorescenciu, čo indikuje pozitívne vzorky na opičie kiahne.

Vreckové laboratórium

Súprava vážila 500 g a puzdro bolo vodotesné a dostatočne kompaktné, aby sa zmestilo do tašky. Komponenty pozostávali z dvoch trojrozmerne vytlačených vyhrievacích blokov – Blok A, ktorý zohrieva vzorky na 80 °C na lýzu vírusového obalu, a Blok B, ktorý zohrieva vzorky na 40 °C na amplifikáciu DNA.

Súprava obsahovala skúmavky obsahujúce lyofilizované enzýmy chránené trehalózou a skúmavky na vzorky obsahujúce roztok chloridu sodného a octanu horečnatého. Súčasťou súpravy bol aj rehydratačný pufor obsahujúci primery a fluorescenčný reportér, ako aj ultrafialová (UV) baterka na detekciu fluorescencie.

Počas testovacieho procesu sa vzorka umiestni do skúmavky a vírusový obal sa lýzuje pomocou zahrievacieho bloku A. Zahriata vzorka sa pridá do skúmavky obsahujúcej lyofilizované enzýmy a pridá sa rehydratačný pufor. Vyhrievací blok B sa potom použije na vystuženie cieľovej oblasti. Nakoniec sa fluorescencia deteguje pomocou UV baterky.

Počas experimentálneho testu výskumníci vykonali pseudotypové vzorky vírusu opičích kiahní, celkový čas bol 25 minút a vzorky obsahujúce iba desať vírusových častíc boli detegované s presnosťou.

Závery

Na záver vedci predstavili novú súpravu na rýchlu detekciu, ktorá bola kompaktná a mohla byť použitá na detekciu vírusu opičích kiahní bez použitia zložitých nástrojov, vyškolených technikov alebo laboratórneho nastavenia.

Detekčná súprava využíva princípy RPA a CRISPR na amplifikáciu cieľových oblastí DNA opičích kiahní a ich štiepenie pomocou komplexu CRISPR/Cas12a, pričom fluorescenčný reportér signalizuje detekciu DNA vírusu opičích kiahní.

Testy s pseudotypovým vírusom ukázali úspešnú a rýchlu detekciu vírusu opičích kiahní, čo naznačuje, že súprava by sa mohla potenciálne použiť na rýchle testovanie cestujúcich a v oblastiach, kde chýba primeraná zdravotnícka infraštruktúra a vyškolený personál.

Referencia:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.