Kompakten komplet za hitro odkrivanje za testiranje virusa Monkeypox kaže obetavne rezultate v novih raziskavah

Kompakten komplet za hitro odkrivanje za testiranje virusa Monkeypox kaže obetavne rezultate v novih raziskavah

V nedavnem poročilu v reviji Potovalna medicina in nalezljive bolezni, so raziskovalci predstavili kompakten komplet za hitro odkrivanje, ki testira viruse opičjih koz s kombinacijo pomnoževanja z rekombinazno polimerazo (RPA) in tehnologije redno prepletenih kratkih palindromskih ponovitev (CRISPR).

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

ozadje

Izbruh opičjih koz se je leta 2022 razširil daleč onkraj endemičnih držav zahodne in osrednje Afrike, Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) pa ga je zdaj razglasila za javnozdravstveno nevarnost mednarodnega pomena. Etiološki povzročitelj opičjih koz je virus opičjih koz, ki spada v rod ortopoksvirusov.

Test, ki se trenutno uporablja za odkrivanje opičjih koz, je test verižne reakcije s polimerazo (PCR), ki pomnoži deoksiribonukleinsko kislino (DNK) ortopoksvirusa ali specifičnih virusov opičjih koz. Vendar pa je PCR dolgotrajen postopek, ki zahteva termocikler, usposobljeno osebje in laboratorij.

Zgodnje odkrivanje in zadrževanje okuženih posameznikov je bistvenega pomena za obvladovanje izbruha bolezni. Imunski testi, kot so trakovi s stranskim tokom, so enostavnejši in hitrejši od PCR, vendar imajo večjo navzkrižno reaktivnost za ortopoksviruse, kar otežuje natančno odkrivanje opičjih koz. Zato je ključnega pomena tehnologija, ki hitro zazna opičje koze in zagotavlja natančne in zanesljive rezultate.

Mehanizem zaznavanja

V tej študiji so raziskovalci razvili komplet za hitro odkrivanje ali žepni laboratorij za testiranje virusa opičjih koz. Komplet za zaznavanje uporablja načela tehnologije RPA in CRISPR za povečanje specifičnosti in občutljivosti analize. RPA pomnoži ciljne gene virusa opičjih koz, ki jih skenirata ribonukleinska kislina (RNA) vodila CRISPR in encim protein 12a (Cas12a), povezan s CRISPR.

CRISPR/Cas12sa posredovana cepitev zaporedja se zgodi le, ko so prepoznani ciljni amplikoni opičjih koz, s čimer se odpravi možnost nespecifičnih signalov. Posledica cepitve je fluorescenca, kar kaže na vzorce, pozitivne na opičje koze.

Žepni laboratorij

Komplet je tehtal 500 g, ohišje pa je bilo vodoodporno in dovolj kompaktno, da ga lahko spravite v torbo. Komponente so sestavljale dva tridimenzionalno natisnjena grelna bloka – blok A, ki segreje vzorce na 80 °C za lizo virusne ovojnice, in blok B, ki segreje vzorce na 40 °C za pomnoževanje DNA.

Komplet je vseboval epruvete, ki so vsebovale liofilizirane encime, zaščitene s trehalozo, in epruvete za vzorce, ki so vsebovale raztopino natrijevega klorida in magnezijevega acetata. V komplet so bili vključeni tudi rehidracijski pufer, ki je vseboval primerje in reporter fluorescence, ter ultravijolično (UV) svetilko za zaznavanje fluorescence.

Med postopkom testiranja se vzorec postavi v epruveto z vzorcem in virusna ovojnica se lizira z uporabo grelnega bloka A. Segret vzorec se doda v epruveto z liofiliziranimi encimi in doda se rehidracijski pufer. Grelni blok B se nato uporabi za ojačitev ciljne regije. Na koncu se fluorescenca zazna z UV svetilko.

Med eksperimentalnim testom so raziskovalci opravili psevdotipizirane vzorce virusa opičjih koz, skupni čas je bil 25 minut, vzorci, ki so vsebovali le deset virusnih delcev, pa so bili natančno odkriti.

Sklepi

Na koncu so raziskovalci predstavili nov komplet za hitro odkrivanje, ki je bil kompakten in bi ga bilo mogoče uporabiti za odkrivanje virusa opičjih koz brez uporabe zapletenih instrumentov, usposobljenih tehnikov ali laboratorijskih nastavitev.

Komplet za odkrivanje uporablja načela RPA in CRISPR za pomnoževanje ciljnih regij DNK opičjih koz in njihovo cepitev z uporabo kompleksa CRISPR/Cas12a, pri čemer fluorescentni reporter signalizira odkrivanje DNK virusa opičjih koz.

Testi s psevdotipiziranim virusom so pokazali uspešno in hitro detekcijo virusa opičjih koz, kar nakazuje, da bi lahko komplet uporabili za hitro testiranje potnikov in na območjih, kjer ni ustrezne zdravstvene infrastrukture in usposobljenega osebja.

Referenca:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.