Compact Rapid Detection Kit för testning av Monkeypox Virus visar lovande resultat i ny forskning

Compact Rapid Detection Kit för testning av Monkeypox Virus visar lovande resultat i ny forskning

I ett färskt reportage i tidningen Resemedicin och infektionssjukdomar, introducerade forskare en kompakt snabb upptäcktsutrustning som testar för appoxvirus genom att använda en kombination av rekombinaspolymerasförstärkning (RPA) och klustrade regelbundet interspaced kort palindromisk upprepning (CRISPR) teknologi.

Lernen: Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Bildquelle: Tatiana Buzmakova/Shutterstock

bakgrund

Appoxutbrottet har spridit sig långt utanför de endemiska länderna i Väst- och Centralafrika 2022, och Världshälsoorganisationen (WHO) har nu förklarat att det är en folkhälsokris av internationell oro. Den etiologiska patogenen för appox är appoxviruset, som tillhör släktet ortopoxvirus.

Testet som för närvarande används för att upptäcka apkoppor är polymeraskedjereaktionstestet (PCR), som förstärker deoxiribonukleinsyran (DNA) från ortopoxvirus eller specifika apkopporvirus. Men PCR är en lång process som kräver en termocykler, utbildad personal och ett laboratorium.

Tidig upptäckt och inneslutning av infekterade individer är avgörande för att kontrollera ett sjukdomsutbrott. Immunanalyser som laterala flödesremsor är enklare och snabbare än PCR, men har högre korsreaktivitet för ortopoxvirus, vilket gör det svårt att hitta korrekt apkoppor. Därför är teknik som upptäcker apkoppor snabbt och ger korrekta och pålitliga resultat avgörande.

Detekteringsmekanism

I den aktuella studien utvecklade forskarna ett kit för snabb upptäckt eller ficklaboratorium för att testa för appoxvirus. Detektionssatsen använder principerna för RPA- och CRISPR-teknologi för att öka analysens specificitet och känslighet. RPA förstärker målgener för appoxvirus som skannas av CRISPR-guiden ribonukleinsyra (RNA) och det CRISPR-associerade protein 12a (Cas12a) enzymet.

CRISPR/Cas12sa-medierad klyvning av sekvensen sker endast när appox-målamplikonerna känns igen, vilket eliminerar möjligheten för ospecifika signaler. Klyvningen resulterar i fluorescens, vilket indikerar appoxpositiva prover.

Ficklabb

Satsen vägde 500g och fodralet var vattentätt och tillräckligt kompakt för att få plats i en väska. Komponenterna bestod av två tredimensionellt tryckta värmeblock – Block A, som värmer proverna till 80 °C för lysering av viral kuvert, och Block B, som värmer proverna till 40 °C för DNA-amplifiering.

Satsen innehöll rör som innehöll trehalosskyddade frystorkade enzymer och provrör innehållande natriumklorid- och magnesiumacetatlösning. En rehydreringsbuffert innehållande primers och fluorescensreportern samt en ultraviolett (UV) ficklampa för att detektera fluorescens inkluderades också i kitet.

Under testprocessen placeras provet i provröret och virushöljet lyseras med hjälp av ett värmeblock A. Det uppvärmda provet läggs till röret som innehåller de lyofiliserade enzymerna och rehydreringsbufferten tillsätts. Värmeblock B används sedan för att förstärka målområdet. Slutligen detekteras fluorescensen med UV-ficklampan.

Under det experimentella testet genomförde forskare pseudotypade appoxvirusprover, den totala tiden var 25 minuter och prover som endast innehöll tio viruspartiklar upptäcktes med noggrannhet.

Slutsatser

Sammanfattningsvis presenterade forskarna ett nytt kit för snabb upptäckt som var kompakt och kunde användas för att upptäcka appoxvirus utan användning av komplicerade instrument, utbildade tekniker eller en laboratorieinstallation.

Detektionssatsen använder principerna för RPA och CRISPR för att amplifiera målregioner av appox-DNA och klyva dem med CRISPR/Cas12a-komplexet, med en fluorescerande reporter som signalerar detektering av appoxvirus-DNA.

Testerna med det pseudotypade viruset visade framgångsrik och snabb upptäckt av appoxviruset, vilket tyder på att kitet potentiellt skulle kunna användas för snabba tester av resenärer och i områden som saknar adekvat medicinsk infrastruktur och utbildad personal.

Hänvisning:

• Wei, J., Meng, X., Li, J. & Pang, B. (2022). Taschenlabor zum schnellen Nachweis des Affenpockenvirus. Reisemedizin und Infektionskrankheiten. tue ich: https://doi.org/10.1016/j.tmaid.2022.102478 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1477893922002241?via%3Dihub

.