Δομική ανάλυση της διπλής φωσφατάσης Η1 του ιού της ευλογιάς των πιθήκων ως στόχος παν-ευλογιάς

Δομική ανάλυση της διπλής φωσφατάσης Η1 του ιού της ευλογιάς των πιθήκων ως στόχος παν-ευλογιάς

Σε πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύτηκε στο bioRxiv * Διακομιστής προεκτύπωσης: Οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι η κρυσταλλική δομή της διπλής ειδικής φωσφατάσης H1 (DSP) του ιού της ευλογιάς των πιθήκων (MPXV) σε ανάλυση 1,8 Å είναι κρίσιμη για την αναπαραγωγή του ιού, καθιστώντας τον έναν ελκυστικό αντιιικό στόχο.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Αυτό το άρθρο ειδήσεων ήταν μια ανασκόπηση μιας προκαταρκτικής επιστημονικής έκθεσης που δεν είχε αξιολογηθεί από ομοτίμους κατά τη στιγμή της δημοσίευσης. Από την αρχική της δημοσίευση, η επιστημονική έκθεση έχει πλέον αξιολογηθεί από ομοτίμους και έγινε αποδεκτή για δημοσίευση σε ακαδημαϊκό περιοδικό. Μπορείτε να βρείτε συνδέσμους για τις προκαταρκτικές αναφορές και τις αναφορές με αξιολόγηση από ομοτίμους στην ενότητα Πηγές στο τέλος αυτού του άρθρου. Προβολή πηγών

Ο αριθμός των κρουσμάτων MPX συνεχίζει να αυξάνεται ανά ώρα παγκοσμίως, δικαιολογώντας την ανάγκη για ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιιικών θεραπειών και εμβολίων για τη βελτίωση της παγκόσμιας ετοιμότητας για MPX και τον περιορισμό ιογενών λοιμώξεων. Το Η1 είναι απαραίτητο για την αντιγραφή του MPXV καθώς αποφωσφορυλιώνει πρωτεΐνες όπως οι A14, F18, A17 και ο μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 1 (STAT1) και αναστέλλει τη σηματοδότηση της ιντερφερόνης (IFN). Είναι σημαντικό ότι το HI διατηρείται μεταξύ των ιών ευλογιάς και ως εκ τούτου μπορεί να στοχευτεί για την ανάπτυξη ευρειών αντιιικών παραγόντων.

Σχετικά με τη μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, οι ερευνητές εξέτασαν την κρυσταλλική δομή H1 σε ανάλυση 1,8 Å για να βελτιώσουν την κατανόηση της αποφωσφορυλίωσης που καταλύεται από MPXV H1 και να αναπτύξουν ένα ακριβές μοντέλο για την ανάπτυξη νέων αντιικών φαρμάκων.

Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) που κωδικοποιεί το Η1 της τρέχουσας απομόνωσης MPXV_USA_2022_MA001 επιδημίας 2022 MPXV συντέθηκε και κλωνοποιήθηκε σε έναν πλασμιδιακό φορέα έκφρασης, ο οποίος επαληθεύτηκε με προσδιορισμό αλληλουχίας. Το Η1 εκφράστηκε σε κύτταρα Escherichia coli BL21 (ή DE3) και τα βακτήρια που εκφράζουν Η1 λύθηκαν, μετά την οποία η πρωτεΐνη υποβλήθηκε σε χρωματογραφική ανάλυση.

Το Η1 κρυσταλλώθηκε χρησιμοποιώντας την τεχνική διάχυσης ατμού καθιστών σταγόνων και οι κρύσταλλοι υποβλήθηκαν σε ανάλυση περίθλασης ακτίνων Χ. Η δομή Η1 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την τεχνική μοριακής αντικατάστασης με τη δομή Η1 του ιού δαμαλίτιδας ως μοντέλο αναζήτησης. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε μια δομική σύγκριση με φωσφατάσες τυροσίνης ανθρώπινης πρωτεΐνης (PTP)/DSP.

Οι συντεταγμένες MPXV-H1 φορτώθηκαν στον διακομιστή Dali και πραγματοποιήθηκαν αναζήτηση για παρόμοια δομημένες πρωτεΐνες στη βάση δεδομένων PDB (βάση δεδομένων πρωτεϊνών) χρησιμοποιώντας το υποσύνολο PDB50. Ως αποτέλεσμα, εντοπίστηκαν δομές 30 φωσφατάσης με σημαντική δομική ομοιότητα (Z-scores >13). Μεταξύ αυτών, δύο ανθρώπινες φωσφατάσες κρυσταλλώθηκαν ως διμερή: ανθρώπινη φωσφατάση διπλής ειδικότητας (hDSP)-5 και 27, και συγκρίθηκαν οι τρόποι διμερισμού τους.

Αποτελέσματα

Το MPXV Η1 περιελάμβανε 171 υπολείμματα με καλά ταιριασμένες πυκνότητες ηλεκτρονίων, ένα ασύμμετρο μόριο Η1 και δύο συμμετρικά ευθυγραμμισμένα μόρια Η1, σχηματίζοντας διμερή σχήματος πεταλούδας και ανταλλάξιμου τομέα. Ολόκληρη η δομή Η1 αποτελούνταν από έξι και τέσσερις άλφα έλικες (α) και βήτα κλώνους (β), αντίστοιχα, με ένα φύλλο β διατεταγμένο στις πλευρές μεταξύ των ελίκων α2 και α3 έως α6.

Οι δύο ενεργές θέσεις εντοπίστηκαν σε απόσταση 39 Α κοντά στα C-άκρα του τερματικού β-κλώνου. Κάθε ενεργό σημείο περιελάμβανε μια τριάδα κυστεΐνης (Cys)-αργινίνης (Arg)-ασπαρτικού οξέος (Asp). Σε κάθε ενεργή θέση, τα διατηρημένα υπολείμματα Arg και Cys εντοπίστηκαν στον βρόχο σύνδεσης φωσφορικών ιόντων μεταξύ των υπολειμμάτων α4 και β4. Το υπόλειμμα Arg116 του βρόχου αιχμαλώτισε φωσφορικά ιόντα των οποίων η ομάδα γουανιδινίου αλληλεπιδρά με δύο μόρια PO (φωσφορικό-οξυγόνο) συνδεδεμένα με δεσμούς υδρογόνου.

Το υπόλειμμα Arg116 εξασφάλισε αποτελεσματικό προσανατολισμό και πρόσδεση του υποστρώματος. Οι Ν-τελικές α1 έλικες κάθε πρωτομερούς ανταλλάχθηκαν για να μεσολαβήσουν διμερισμοί Η1. Οι έλικες α1 ενός μοναδικού πρωτομερούς Η1 σχημάτισαν μια δεσμευμένη δομή με τρεις έλικες α4 έως α6 των αντίστοιχων προαγωγών που εμπλέκονται στη σύζευξη. Στη βάση του καταλυτικού θύλακα, το υπόλειμμα Cys110 επιτέθηκε σε άτομα φωσφόρου κατά την αποφωσφορυλίωση, με αποτέλεσμα τον παροδικό σχηματισμό ενός ενζύμου-φωσφορικού ενδιάμεσου, το οποίο υδρολύθηκε για να αναγεννήσει ανόργανο φωσφορικό και ένζυμο.

Το άτομο θείου του υπολείμματος Cys110 τοποθετήθηκε παράλληλα με τον δεσμό PO, ο οποίος αντιστοιχεί στον δεσμό που σχηματίστηκε κατά την αναγέννηση του ενζύμου. Το υπόλειμμα Asp79 ενεπλάκη σε συντονισμό με το μόριο του νερού και έδρασε ως οξύ, διευκολύνοντας τον σχηματισμό και την υδρόλυση του ενδιάμεσου. Έτσι, η δομή Η1 έδειξε το τελευταίο καταλυτικό στάδιο πριν από την απελευθέρωση του προϊόντος.

Η επιφάνεια που θαμμένη μεταξύ δύο προαγωγών απείχε 1000 Α2 μεταξύ τους και σταθεροποιήθηκε με υδρόφοβες και υδρόφιλες αλληλεπιδράσεις. Τα υπολείμματα σερίνης (Ser)14 και τα υπολείμματα θρεονίνης (Thr)15 στην α1 έδειξαν δεσμούς υδρογόνου με υπολείμματα ιστιδίνης (His)143 και υπολείμματα τυροσίνης (Tyr)142/λυσίνη (Lys)159 του αντίστοιχου πρωτομερούς Η1, αντίστοιχα. Αντίθετα, τα υπολείμματα Tyr7, λευκίνη (Leu)11 και Leu12 συμμετείχαν σε υδρόφοβους δεσμούς με υπολείμματα μεθειονίνη (Met)135, Leu139, Lys159, ισολευκίνη (Ile)163, βαλίνη (Val)167 και Ile168 από το ζεύγος H1.

Τα υπολείμματα Leu136, Leu139 και Met135 στην α5 αντιτάχθηκαν από υπολείμματα διμερούς που σχετίζονται με συμμετρία για να επεκτείνουν την υδρόφοβη διεπιφάνεια δέσμευσης. Το υπόλειμμα α1 σταθεροποιήθηκε χρησιμοποιώντας υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των υπολειμμάτων α1 και α5. Το διμερές Η1 επιβεβαιώθηκε σε χρωματογραφική ανάλυση, υποδεικνύοντας ότι τα διμερή αντιπροσώπευαν λειτουργικές καταστάσεις.

Η κρυσταλλική δομή MPXV H1 αποκάλυψε δύο hotspot για την ανάπτυξη νέων αντιικών φαρμάκων. Η θέση επαφής του διμερούς είναι ένα hotspot μοναδικό για τα μόρια PTP/DSP. Η αναστολή του διμερισμού Η1 θα μπορούσε ενδεχομένως να αναστείλει τον διμερισμό και την αποφωσφορυλίωση του ενεργοποιημένου ομοδιμερούς φωσφόρου-τυροσίνης STAT1. Το δεύτερο hotspot είναι το ενεργό σημείο, το οποίο, αν και βρίσκεται γύρω από τους βρόχους δέσμευσης φωσφορικών ιόντων με συγκρίσιμες δομές κορμού, έχει διαφορετικές πλευρικές αλυσίδες και επομένως η εξειδίκευση του υποστρώματος μπορεί να αλλοιωθεί, ανοίγοντας το δρόμο για την ανάπτυξη αντιιικών φαρμάκων.

Συνολικά, τα αποτελέσματα της μελέτης αποκάλυψαν την κρυσταλλική δομή H1 υψηλής ανάλυσης, η οποία παρέχει μια σταθερή βάση για περαιτέρω μηχανιστική ανάλυση και ανάπτυξη νέων αντιικών φαρμάκων κατά των αναδυόμενων ιικών παθογόνων.

Αυτό το άρθρο ειδήσεων ήταν μια ανασκόπηση μιας προκαταρκτικής επιστημονικής έκθεσης που δεν είχε αξιολογηθεί από ομοτίμους κατά τη στιγμή της δημοσίευσης. Από την αρχική της δημοσίευση, η επιστημονική έκθεση έχει πλέον αξιολογηθεί από ομοτίμους και έγινε αποδεκτή για δημοσίευση σε ακαδημαϊκό περιοδικό. Μπορείτε να βρείτε συνδέσμους για τις προκαταρκτικές αναφορές και τις αναφορές με αξιολόγηση από ομοτίμους στην ενότητα Πηγές στο τέλος αυτού του άρθρου. Προβολή πηγών

Παραπομπές:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.