Análisis estructural de la fosfatasa dual H1 del virus de la viruela del simio como objetivo del pan-poxvirus

Análisis estructural de la fosfatasa dual H1 del virus de la viruela del simio como objetivo del pan-poxvirus

En un estudio reciente publicado en bioRxiv * Servidor de preimpresión: Los investigadores determinaron que la estructura cristalina de la fosfatasa H1 específica dual (DSP) del virus de la viruela del simio (MPXV) con una resolución de 1,8 Å es fundamental para la replicación del virus, lo que la convierte en un objetivo antiviral atractivo.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no había sido revisado por pares en el momento de su publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista académica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados ​​por pares se pueden encontrar en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes

El número de casos de MPX continúa aumentando cada hora en todo el mundo, lo que justifica la necesidad de desarrollar vacunas y terapias antivirales eficaces para mejorar la preparación global para el MPX y contener las infecciones virales. H1 es esencial para la replicación de MPXV ya que desfosforila proteínas como A14, F18, A17 y el transductor de señal y activador de la transcripción 1 (STAT1) e inhibe la señalización del interferón (IFN). Es importante destacar que la HI se conserva entre los poxvirus y, por lo tanto, puede ser el objetivo del desarrollo de agentes antivirales amplios.

Sobre el estudio

En el presente estudio, los investigadores examinaron la estructura cristalina H1 con una resolución de 1,8 Å para mejorar la comprensión de la desfosforilación catalizada por MPXV H1 y desarrollar un modelo preciso para el desarrollo de nuevos fármacos antivirales.

El ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifica H1 del aislado MPXV_USA_2022_MA001 del actual brote de MPXV de 2022 se sintetizó y se clonó en un vector plasmídico de expresión, que se verificó mediante secuenciación. H1 se expresó en células de Escherichia coli BL21 (o DE3) y se lisaron bacterias que expresaban H1, después de lo cual la proteína se sometió a análisis cromatográfico.

El H1 se cristalizó utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada y los cristales se sometieron a análisis de difracción de rayos X. La estructura H1 se determinó mediante la técnica de reemplazo molecular con la estructura H1 del virus vaccinia como modelo de búsqueda. A continuación se llevó a cabo una comparación estructural con proteínas tirosina fosfatasas (PTP)/DSP fosfatasas humanas.

Las coordenadas MPXV-H1 se cargaron en el servidor Dali y se buscaron proteínas con estructura similar en la PDB (base de datos de proteínas) utilizando el subconjunto PDB50. Como resultado, se identificaron estructuras de 30 fosfatasas con similitud estructural significativa (puntuaciones Z >13). Entre ellas, se cristalizaron dos fosfatasas humanas como dímeros: la fosfatasa humana de doble especificidad (hDSP) -5 y 27, y se compararon sus modos de dimerización.

Resultados

MPXV H1 constaba de 171 residuos con densidades de electrones bien coincidentes, una molécula de H1 asimétrica y dos moléculas de H1 alineadas simétricamente, formando dímeros con forma de mariposa y con dominio intercambiado. Toda la estructura H1 constaba de seis y cuatro hélices alfa (α) y hebras beta (β), respectivamente, con una lámina β dispuesta en los lados entre las hélices α2 y α3 a α6.

Los dos sitios activos estaban ubicados a una distancia de 39 Å cerca de los terminales C de la cadena β terminal. Cada sitio activo comprendía una tríada cisteína (Cys)-arginina (Arg)-ácido aspártico (Asp). En cada sitio activo, los residuos Arg y Cys conservados se ubicaron en el bucle de unión del ion fosfato entre los residuos α4 y β4. El residuo Arg116 del bucle capturó iones fosfato cuyo grupo guanidinio interactuó con dos moléculas de PO (fosfato-oxígeno) conectadas por enlaces de hidrógeno.

El residuo Arg116 aseguró una orientación y unión eficiente del sustrato. Las hélices α1 N-terminales de cada protómero se intercambiaron para mediar en las dimerizaciones H1. Las hélices α1 de un único protómero H1 formaron una estructura agrupada con tres hélices α4 a α6 de los promotores correspondientes implicados en el emparejamiento. En la base de la bolsa catalítica, el residuo Cys110 atacó los átomos de fósforo durante la desfosforilación, lo que resultó en la formación transitoria de un intermedio enzima-fosfato, que se hidrolizó para regenerar fosfato inorgánico y enzima.

El átomo de azufre del residuo Cys110 se colocó paralelo al enlace PO, que corresponde al enlace formado tras la regeneración de la enzima. El residuo Asp79 participó en coordinación con la molécula de agua y actuó como un ácido, facilitando la formación e hidrólisis del intermedio. Por tanto, la estructura H1 indicó el último paso catalítico antes de la liberación del producto.

La superficie enterrada entre dos promotores estaba separada por 1000 Å2 y estaba estabilizada mediante interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas. Los residuos de serina (Ser)14 y los residuos de treonina (Thr)15 en α1 mostraron enlaces de hidrógeno con residuos de histidina (His)143 y residuos de tirosina (Tyr)142/residuos de lisina (Lys)159 del protómero H1 correspondiente, respectivamente. Por el contrario, los residuos Tyr7, leucina (Leu)11 y Leu12 participaron en enlaces hidrófobos con los residuos metionina (Met)135, Leu139, Lys159, isoleucina (Ile)163, valina (Val)167 e Ile168 del emparejamiento H1.

Los residuos Leu136, Leu139 y Met135 en α5 se opusieron a residuos dímeros asociados a la simetría para extender la interfaz de unión hidrófoba. El residuo α1 se estabilizó mediante interacciones hidrófobas y enlaces de hidrógeno intramoleculares entre los residuos α1 y α5. El dímero H1 se confirmó en análisis cromatográfico, lo que indica que los dímeros representaban estados funcionales.

La estructura cristalina del MPXV H1 reveló dos puntos críticos para el desarrollo de nuevos fármacos antivirales. El sitio de contacto del dímero es un punto de acceso exclusivo de las moléculas de PTP/DSP. La inhibición de la dimerización H1 podría potencialmente inhibir la dimerización y desfosforilación del homodímero de fósforo-tirosina STAT1 activado. El segundo punto crítico es el sitio activo, que, aunque se encuentra alrededor de los bucles de unión del ion fosfato con estructuras principales comparables, tiene cadenas laterales diferentes y, por lo tanto, la especificidad del sustrato puede verse alterada, allanando el camino para el desarrollo de fármacos antivirales.

En general, los resultados del estudio revelaron la estructura cristalina H1 de alta resolución, que proporciona una base sólida para un mayor análisis mecanicista y el desarrollo de nuevos fármacos antivirales contra patógenos virales emergentes.

Este artículo de noticias fue una revisión de un informe científico preliminar que no había sido revisado por pares en el momento de su publicación. Desde su publicación inicial, el informe científico ha sido revisado por pares y aceptado para su publicación en una revista académica. Los enlaces a los informes preliminares y revisados ​​por pares se pueden encontrar en la sección Fuentes al final de este artículo. Ver fuentes

Referencias:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

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