Apinarokkoviruksen H1-kaksoisfosfataasin rakenneanalyysi pan-poxviruskohteena

Apinarokkoviruksen H1-kaksoisfosfataasin rakenneanalyysi pan-poxviruskohteena

Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa bioRxiv * Preprint-palvelin: Tutkijat päättelivät, että apinapoxviruksen (MPXV) kaksoisspesifisen H1-fosfataasin (DSP) kiderakenne 1,8 Å:n resoluutiolla on kriittinen viruksen replikaatiolle, mikä tekee siitä houkuttelevan antiviraalisen kohteen.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

MPX-tapausten määrä kasvaa edelleen tunneittain maailmanlaajuisesti, mikä oikeuttaa tehokkaiden viruslääkkeiden ja rokotteiden kehittämisen MPX-valmiuden parantamiseksi ja virusinfektioiden hillitsemiseksi. H1 on välttämätön MPXV:n replikaatiolle, koska se defosforyloi proteiineja, kuten A14, F18, A17 ja signaalinmuuntimen ja transkription 1:n aktivaattorin (STAT1) ja estää interferoni (IFN) signalointia. Tärkeää on, että HI on konservoitunut poxvirusten joukossa, ja siksi se voidaan kohdentaa laajojen antiviraalisten aineiden kehittämiseen.

Tietoja tutkimuksesta

Tässä tutkimuksessa tutkijat tutkivat H1-kiderakennetta 1,8 Å:n resoluutiolla parantaakseen MPXV:n H1-katalysoiman defosforylaation ymmärtämistä ja kehittääkseen tarkan mallin uusien viruslääkkeiden kehittämiseen.

Nykyisen 2022 MPXV-epidemiaa MPXV_USA_2022_MA001-isolaatin Hl:tä koodaava deoksiribonukleiinihappo (DNA) syntetisoitiin ja kloonattiin ekspressioplasmidivektoriin, joka varmistettiin sekvensoimalla. H1 ekspressoitiin Escherichia coli BL21 (tai DE3) -soluissa ja Hl:tä ilmentävät bakteerit hajotettiin, minkä jälkeen proteiinille suoritettiin kromatografinen analyysi.

H1 kiteytettiin käyttämällä istuvan pisarahöyrydiffuusiotekniikkaa ja kiteille suoritettiin röntgendiffraktioanalyysi. H1-rakenne määritettiin käyttämällä molekyylikorvaustekniikkaa ja vacciniaviruksen H1-rakennetta hakumallina. Sitten suoritettiin rakenteellinen vertailu ihmisen proteiinityrosiinifosfataaseihin (PTP)/DSP-fosfataaseihin.

MPXV-H1-koordinaatit ladattiin Dali-palvelimelle ja etsittiin samalla tavalla rakenteellisia proteiineja PDB:stä (proteiinitietokanta) käyttämällä PDB50-alajoukkoa. Tuloksena tunnistettiin 30 fosfataasin rakenteet, joilla oli merkittävää rakenteellista samankaltaisuutta (Z-pisteet > 13). Niistä kaksi ihmisen fosfataasia kiteytettiin dimeerinä: ihmisen kaksoisspesifinen fosfataasi (hDSP)-5 ja 27, ja niiden dimerisaatiotapoja verrattiin.

Tulokset

MPXV H1 sisälsi 171 tähdettä, joilla oli hyvin yhteensopivia elektronitiheyksiä, yhden asymmetrisen H1-molekyylin ja kaksi symmetrisesti kohdistettua H1-molekyyliä, jotka muodostivat perhosen muotoisia ja domeenilla vaihdettuja dimeerejä. Koko H1-rakenne koostui kuudesta ja neljästä alfa-heliksistä (α) ja beeta-säikeestä (β), vastaavasti, ja β-levy oli järjestetty sivuille heliksien α2 ja α3 - α6 väliin.

Kaksi aktiivista kohtaa sijaitsivat 39 Å:n etäisyydellä terminaalisen β-juosteen C-terminaaleista. Jokainen aktiivinen kohta käsitti kysteiini (Cys) - arginiini (Arg) - asparagiinihappo (Asp) -triadin. Jokaisessa aktiivisessa kohdassa konservoituneet Arg- ja Cys-tähteet sijaitsivat fosfaatti-ioneja sitovassa silmukassa a4- ja p4-tähteiden välissä. Silmukan Arg116-jäännös vangitsi fosfaatti-ioneja, joiden guanidiiniryhmä oli vuorovaikutuksessa kahden vetysidoksilla yhdistetyn PO (fosfaatti-happi) -molekyylin kanssa.

Arg116-jäännös varmisti tehokkaan substraatin orientaation ja sitoutumisen. Kunkin protomeerin N-terminaaliset a1-heliksit vaihdettiin välittämään H1-dimerisaatioita. Yhden H1-protomeerin a1-heliksit muodostivat niputetun rakenteen, jossa oli kolme a4-a6-heliksiä vastaavista promoottorista, jotka osallistuivat parin muodostukseen. Katalyyttisen taskun pohjassa Cys110-jäännös hyökkäsi fosforiatomeihin defosforylaation aikana, mikä johti väliaikaiseen entsyymi-fosfaattivälituotteen muodostumiseen, joka hydrolysoitiin epäorgaanisen fosfaatin ja entsyymin regeneroimiseksi.

Cys110-tähteen rikkiatomi sijoitettiin samansuuntaisesti PO-sidoksen kanssa, mikä vastaa sidosta, joka muodostui entsyymin regeneroinnissa. Asp79-tähde osallistui koordinaatioon vesimolekyylin kanssa ja toimi happona, mikä helpotti välituotteen muodostumista ja hydrolyysiä. Siten H1-rakenne osoitti viimeisen katalyyttisen vaiheen ennen tuotteen vapautumista.

Kahden promoottorin väliin haudattu pinta oli 1000 Å2:n päässä toisistaan ​​ja stabiloitui hydrofobisilla ja hydrofiilisillä vuorovaikutuksilla. Seriinitähteet (Ser)14 ja treoniinitähteet (Thr)15 α1:ssä osoittivat vetysidoksia vastaavan H1-protomeerin histidiinitähteiden (His)143 ja tyrosiinitähteiden (Tyr)142/lysiinitähteiden (Lys)159 kanssa. Sitä vastoin tähteet Tyr7, leusiini (Leu)11 ja Leu12 osallistuivat hydrofobisiin sidoksiin tähteiden metioniini (Met)135, Leu139, Lys159, isoleusiini (Ile)163, valiini (Val)167 ja Ile168 kanssa H1-parirenkaasta.

Leu136-, Leu139- ja Met135-tähteet a5:ssä vastustivat symmetriaan liittyvät dimeeritähteet hydrofobisen sitoutumisrajapinnan pidentämiseksi. a1-tähde stabiloitiin käyttämällä hydrofobisia vuorovaikutuksia ja molekyylinsisäisiä vetysidoksia a1- ja a5-tähteiden välillä. H1-dimeeri varmistettiin kromatografisessa analyysissä, mikä osoitti, että dimeerit edustivat toiminnallisia tiloja.

MPXV H1 -kiderakenne paljasti kaksi hotspotia uusien viruslääkkeiden kehittämiselle. Dimeerikontaktikohta on PTP/DSP-molekyyleille ainutlaatuinen hotspot. H1-dimerisoitumisen estäminen voisi mahdollisesti estää aktivoidun STAT1-fosfori-tyrosiinihomodimeerin dimerisaatiota ja defosforylaatiota. Toinen hotspot on aktiivinen kohta, joka sijaitsee fosfaatti-ioneja sitovien silmukoiden ympärillä, joilla on vertailukelpoinen runkorakenne, mutta jolla on erilaiset sivuketjut ja siksi substraattispesifisyys voi muuttua, mikä tasoittaa tietä viruslääkkeiden kehitykselle.

Kaiken kaikkiaan tutkimustulokset paljastivat korkearesoluutioisen H1-kiderakenteen, joka tarjoaa vankan perustan myöhemmälle mekanistiselle analyysille ja uusien viruslääkkeiden kehittämiselle nousevia viruspatogeenejä vastaan.

Tämä uutisartikkeli oli katsaus alustavaan tieteelliseen raporttiin, jota ei ollut vertaisarvioitu julkaisuhetkellä. Alkuperäisen julkaisunsa jälkeen tieteellinen raportti on nyt vertaisarvioitu ja hyväksytty julkaistavaksi akateemisessa lehdessä. Linkit alustaviin ja vertaisarvioituihin raportteihin löytyvät tämän artikkelin lopun Lähteet-osiosta. Näytä lähteet

Viitteet:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.