Analisi strutturale della doppia fosfatasi H1 del virus del vaiolo delle scimmie come bersaglio del pan-poxvirus

Analisi strutturale della doppia fosfatasi H1 del virus del vaiolo delle scimmie come bersaglio del pan-poxvirus

In un recente studio pubblicato su bioRxiv * Server di prestampa: i ricercatori hanno determinato che la struttura cristallina della fosfatasi H1 doppia specifica (DSP) del virus del vaiolo delle scimmie (MPXV) con una risoluzione di 1,8 Å è fondamentale per la replicazione del virus, rendendolo un attraente bersaglio antivirale.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

Il numero di casi di MPX continua ad aumentare di ora in ora in tutto il mondo, giustificando la necessità di sviluppare terapie antivirali e vaccini efficaci per migliorare la preparazione globale all’MPX e contenere le infezioni virali. H1 è essenziale per la replicazione di MPXV poiché defosforila proteine ​​come A14, F18, A17 e il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 1 (STAT1) e inibisce la segnalazione dell'interferone (IFN). È importante sottolineare che l'HI è conservato tra i poxvirus e può quindi essere preso di mira per lo sviluppo di agenti antivirali di ampia portata.

A proposito dello studio

Nel presente studio, i ricercatori hanno esaminato la struttura cristallina dell'H1 con una risoluzione di 1,8 Å per migliorare la comprensione della defosforilazione catalizzata da H1 dell'MPXV e per sviluppare un modello preciso per lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali.

L'acido desossiribonucleico (DNA) che codifica H1 dell'isolato MPXV_USA_2022_MA001 dell'attuale epidemia di MPXV del 2022 è stato sintetizzato e clonato in un vettore plasmidico di espressione, che è stato verificato mediante sequenziamento. H1 è stato espresso nelle cellule Escherichia coli BL21 (o DE3) e i batteri che esprimono H1 sono stati lisati, dopo di che la proteina è stata sottoposta ad analisi cromatografica.

H1 è stato cristallizzato utilizzando la tecnica di diffusione del vapore a goccia seduta e i cristalli sono stati sottoposti ad analisi di diffrazione di raggi X. La struttura H1 è stata determinata utilizzando la tecnica di sostituzione molecolare con la struttura H1 del virus vaccinico come modello di ricerca. È stato quindi effettuato un confronto strutturale con le fosfatasi proteiche umane della tirosina fosfatasi (PTP)/DSP.

Le coordinate MPXV-H1 sono state caricate sul server Dali e cercate proteine ​​strutturate in modo simile nel PDB (database delle proteine) utilizzando il sottoinsieme PDB50. Di conseguenza, sono state identificate strutture di 30 fosfatasi con significativa somiglianza strutturale (punteggi Z> 13). Tra questi, due fosfatasi umane sono state cristallizzate come dimeri: fosfatasi umana a doppia specificità (hDSP) -5 e 27, e sono state confrontate le loro modalità di dimerizzazione.

Risultati

MPXV H1 comprendeva 171 residui con densità elettroniche ben abbinate, una molecola H1 asimmetrica e due molecole H1 allineate simmetricamente, formando dimeri a forma di farfalla e con scambio di dominio. L'intera struttura H1 consisteva rispettivamente di sei e quattro eliche alfa (α) e filamenti beta (β), con un foglio β disposto sui lati tra le eliche α2 e da α3 a α6.

I due siti attivi erano situati ad una distanza di 39 Å vicino ai terminali C del filamento β terminale. Ciascun sito attivo comprendeva una triade cisteina (Cys)-arginina (Arg)-acido aspartico (Asp). In ciascun sito attivo, i residui conservati di Arg e Cys erano situati nel circuito di legame dello ione fosfato tra i residui α4 e β4. Il residuo Arg116 del circuito ha catturato ioni fosfato il cui gruppo guanidinio ha interagito con due molecole di PO (fosfato-ossigeno) collegate da legami idrogeno.

Il residuo di Arg116 assicurava un orientamento e un legame efficienti del substrato. Le eliche α1 N-terminali di ciascun protomero sono state scambiate per mediare le dimerizzazioni H1. Le eliche α1 di un singolo protomero H1 formavano una struttura a fascio con tre eliche da α4 ad α6 dei corrispondenti promotori coinvolti nell'appaiamento. Alla base della tasca catalitica, il residuo Cys110 ha attaccato gli atomi di fosforo durante la defosforilazione, provocando la formazione transitoria di un intermedio enzima-fosfato, che è stato idrolizzato per rigenerare il fosfato inorganico e l'enzima.

L'atomo di zolfo del residuo Cys110 era posizionato parallelo al legame PO, che corrisponde al legame formato durante la rigenerazione dell'enzima. Il residuo Asp79 era coinvolto nella coordinazione con la molecola d'acqua e agiva come un acido, facilitando la formazione e l'idrolisi dell'intermedio. Pertanto, la struttura H1 indicava l'ultimo passaggio catalitico prima del rilascio del prodotto.

La superficie sepolta tra due promotori era distante 1000 Å2 ed era stabilizzata da interazioni idrofobiche e idrofile. I residui di serina (Ser)14 e i residui di treonina (Thr)15 in α1 mostravano legami idrogeno con i residui di istidina (His)143 e i residui di tirosina (Tyr)142/residui di lisina (Lys)159 del corrispondente protomero H1, rispettivamente. Al contrario, i residui Tyr7, leucina (Leu)11 e Leu12 hanno partecipato a legami idrofobici con i residui metionina (Met)135, Leu139, Lys159, isoleucina (Ile)163, valina (Val)167 e Ile168 dall'accoppiamento H1.

I residui Leu136, Leu139 e Met135 in α5 erano contrastati da residui dimerici associati alla simmetria per estendere l'interfaccia di legame idrofobico. Il residuo α1 è stato stabilizzato utilizzando interazioni idrofobiche e legami idrogeno intramolecolari tra i residui α1 e α5. Il dimero H1 è stato confermato nell'analisi cromatografica, indicando che i dimeri rappresentavano stati funzionali.

La struttura cristallina dell'MPXV H1 ha rivelato due punti caldi per lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali. Il sito di contatto del dimero è un hotspot esclusivo delle molecole PTP/DSP. L'inibizione della dimerizzazione di H1 potrebbe potenzialmente inibire la dimerizzazione e la defosforilazione dell'omodimero di fosforo-tirosina STAT1 attivato. Il secondo hotspot è il sito attivo, che, sebbene situato attorno ai circuiti di legame degli ioni fosfato con strutture portanti comparabili, ha catene laterali diverse e quindi la specificità del substrato può essere alterata, aprendo la strada allo sviluppo di farmaci antivirali.

Nel complesso, i risultati dello studio hanno rivelato la struttura cristallina H1 ad alta risoluzione, che fornisce una solida base per ulteriori analisi meccanicistiche e lo sviluppo di nuovi farmaci antivirali contro i patogeni virali emergenti.

Questo articolo di notizie era una revisione di un rapporto scientifico preliminare che non era stato sottoposto a revisione paritaria al momento della pubblicazione. Dalla sua pubblicazione iniziale, il rapporto scientifico è stato ora sottoposto a revisione paritaria e accettato per la pubblicazione in una rivista accademica. I collegamenti ai rapporti preliminari e sottoposti a revisione paritaria possono essere trovati nella sezione Fonti alla fine di questo articolo. Visualizza fonti

Riferimenti:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.