Structurele analyse van het apenpokkenvirus H1 dubbele fosfatase als doelwit voor het panpokkenvirus

Structurele analyse van het apenpokkenvirus H1 dubbele fosfatase als doelwit voor het panpokkenvirus

Uit een recente studie gepubliceerd in bioRxiv * Preprint-server: Onderzoekers hebben vastgesteld dat de kristalstructuur van het apenpokkenvirus (MPXV) dual-specifieke H1-fosfatase (DSP) bij een resolutie van 1,8 Å cruciaal is voor virusreplicatie, waardoor het een aantrekkelijk antiviraal doelwit wordt.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Het aantal MPX-gevallen blijft wereldwijd elk uur toenemen, wat de noodzaak rechtvaardigt van de ontwikkeling van effectieve antivirale therapieën en vaccins om de mondiale paraatheid voor MPX te verbeteren en virale infecties in te dammen. H1 is essentieel voor MPXV-replicatie omdat het eiwitten zoals A14, F18, A17 en signaaltransducer en activator van transcriptie 1 (STAT1) defosforyleert en de interferon-signalering (IFN) remt. Belangrijk is dat HI onder pokkenvirussen geconserveerd is en daarom kan worden ingezet voor de ontwikkeling van brede antivirale middelen.

Over de studie

In de huidige studie onderzochten onderzoekers de H1-kristalstructuur met een resolutie van 1,8 Å om het begrip van MPXV H1-gekatalyseerde defosforylering te verbeteren en een nauwkeurig model te ontwikkelen voor de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen.

Het deoxyribonucleïnezuur (DNA) dat codeert voor H1 van de huidige MPXV-uitbraak MPXV_USA_2022_MA001-isolaat uit 2022 werd gesynthetiseerd en gekloneerd in een expressieplasmidevector, die werd geverifieerd door middel van sequencing. H1 werd tot expressie gebracht in Escherichia coli BL21 (of DE3) cellen en bacteriën die H1 tot expressie brachten werden gelyseerd, waarna het eiwit werd onderworpen aan chromatografische analyse.

H1 werd gekristalliseerd met behulp van de 'sitting drop vapor diffusion'-techniek en de kristallen werden onderworpen aan röntgendiffractieanalyse. De H1-structuur werd bepaald met behulp van de moleculaire vervangingstechniek met de H1-structuur van het vacciniavirus als zoekmodel. Vervolgens werd een structurele vergelijking met menselijke proteïnetyrosinefosfatasen (PTP)/DSP-fosfatasen uitgevoerd.

MPXV-H1-coördinaten werden geüpload naar de Dali-server en gezocht naar vergelijkbaar gestructureerde eiwitten in de PDB (eiwitdatabase) met behulp van de PDB50-subset. Als resultaat werden structuren van 30 fosfatasen met significante structurele gelijkenis geïdentificeerd (Z-scores> 13). Onder hen werden twee menselijke fosfatasen gekristalliseerd als dimeren: menselijke fosfatase met dubbele specificiteit (hDSP) -5 en 27, en hun dimerisatiemodi werden vergeleken.

Resultaten

MPXV H1 bestond uit 171 residuen met goed passende elektronendichtheden, één asymmetrisch H1-molecuul en twee symmetrisch uitgelijnde H1-moleculen, die vlindervormige en domein-verwisselde dimeren vormden. De gehele H1-structuur bestond uit respectievelijk zes en vier alfa-helices (α) en bèta-strengen (β), met een β-vel gerangschikt aan de zijkanten tussen helices α2 en α3 tot α6.

De twee actieve plaatsen bevonden zich op een afstand van 39 Å nabij de C-terminals van de terminale β-streng. Elke actieve plaats omvatte een cysteïne (Cys)-arginine (Arg)-asparaginezuur (Asp) triade. In elke actieve plaats bevonden de geconserveerde Arg- en Cys-residuen zich in de fosfaationenbindende lus tussen de a4- en β4-residuen. Het Arg116-residu van de lus ving fosfaationen op waarvan de guanidiniumgroep een interactie aanging met twee PO-moleculen (fosfaat-zuurstof) verbonden door waterstofbruggen.

Het Arg116-residu zorgde voor een efficiënte substraatoriëntatie en -binding. De N-terminale al-helices van elk protomeer werden uitgewisseld om H1-dimerisaties te bemiddelen. De α1-helices van een enkel H1-protomeer vormden een gebundelde structuur met drie α4- tot α6-helices van de overeenkomstige promoters die betrokken zijn bij het paren. Aan de basis van de katalytische pocket viel het Cys110-residu fosforatomen aan tijdens defosforylering, resulterend in de tijdelijke vorming van een enzym-fosfaattussenproduct, dat werd gehydrolyseerd om anorganisch fosfaat en enzym te regenereren.

Het zwavelatoom van het Cys110-residu was parallel aan de PO-binding gepositioneerd, wat overeenkomt met de binding die werd gevormd bij regeneratie van het enzym. Het Asp79-residu was betrokken bij de coördinatie met het watermolecuul en werkte als een zuur, waardoor de vorming en hydrolyse van het tussenproduct werd vergemakkelijkt. De H1-structuur gaf dus de laatste katalytische stap vóór de productvrijgave aan.

Het oppervlak begraven tussen twee promoters lag 1000 A2 uit elkaar en werd gestabiliseerd door hydrofobe en hydrofiele interacties. De serineresiduen (Ser)14 en threonineresiduen (Thr)15 in al vertoonden waterstofbindingen met respectievelijk histidineresiduen (His)143 en tyrosineresiduen (Tyr)142/lysineresiduen (Lys)159 van het overeenkomstige H1-protomeer. Daarentegen namen de residuen Tyr7, leucine (Leu)11 en Leu12 deel aan hydrofobe bindingen met de residuen methionine (Met)135, Leu139, Lys159, isoleucine (Ile)163, valine (Val)167 en Ile168 uit de H1-koppeling.

De Leu136-, Leu139- en Met135-residuen in a5 werden tegengewerkt door symmetrie-geassocieerde dimeerresiduen om het hydrofobe bindingsgrensvlak uit te breiden. Het α1-residu werd gestabiliseerd met behulp van hydrofobe interacties en intramoleculaire waterstofbruggen tussen de α1- en α5-residuen. Het H1-dimeer werd bevestigd in chromatografische analyse, wat aangeeft dat de dimeren functionele toestanden vertegenwoordigden.

De MPXV H1-kristalstructuur onthulde twee hotspots voor de ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen. De dimeercontactplaats is een hotspot die uniek is voor PTP/DSP-moleculen. Remming van H1-dimerisatie zou mogelijk de dimerisatie en defosforylering van het geactiveerde STAT1 fosfor-tyrosinehomodimeer kunnen remmen. De tweede hotspot is de actieve plaats, die, hoewel gelegen rond de fosfaationenbindende lussen met vergelijkbare ruggengraatstructuren, verschillende zijketens heeft en daarom de substraatspecificiteit kan worden gewijzigd, wat de weg vrijmaakt voor de ontwikkeling van antivirale geneesmiddelen.

Over het geheel genomen onthulden de onderzoeksresultaten de H1-kristalstructuur met hoge resolutie, die een solide basis biedt voor verdere mechanistische analyse en ontwikkeling van nieuwe antivirale geneesmiddelen tegen opkomende virale pathogenen.

Dit nieuwsartikel was een recensie van een voorlopig wetenschappelijk rapport dat op het moment van publicatie nog niet door vakgenoten was beoordeeld. Sinds de eerste publicatie is het wetenschappelijk rapport nu peer-reviewed en geaccepteerd voor publicatie in een academisch tijdschrift. Links naar de voorlopige en peer-reviewed rapporten zijn te vinden in de sectie Bronnen aan het einde van dit artikel. Bekijk bronnen

Referenties:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.