Strukturell analyse av monkeypox virus H1 dobbel fosfatase som et pan-poxvirus mål

Strukturell analyse av monkeypox virus H1 dobbel fosfatase som et pan-poxvirus mål

I en fersk studie publisert i bioRxiv * Preprint-server: Forskere fastslo at krystallstrukturen til monkeypox virus (MPXV) dobbeltspesifikk H1-fosfatase (DSP) ved 1,8 Å oppløsning er kritisk for virusreplikasjon, noe som gjør den til et attraktivt antiviralt mål.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Antallet MPX-tilfeller fortsetter å øke hver time over hele verden, noe som rettferdiggjør behovet for utvikling av effektive antivirale medisiner og vaksiner for å forbedre den globale beredskapen for MPX og inneholde virusinfeksjoner. H1 er essensielt for MPXV-replikasjon da det defosforylerer proteiner som A14, F18, A17 og signaltransduser og aktivator av transkripsjon 1 (STAT1) og hemmer interferon (IFN) signalering. Viktigere er at HI er bevart blant poxvirus og kan derfor målrettes mot utvikling av brede antivirale midler.

Om studiet

I denne studien undersøkte forskere H1-krystallstrukturen ved 1,8 Å-oppløsning for å forbedre forståelsen av MPXV H1-katalysert defosforylering og for å utvikle en presis modell for utvikling av nye antivirale legemidler.

Deoksyribonukleinsyren (DNA) som koder for H1 fra det nåværende 2022 MPXV-utbruddet MPXV_USA_2022_MA001-isolatet ble syntetisert og klonet inn i en ekspresjonsplasmidvektor, som ble verifisert ved sekvensering. H1 ble uttrykt i Escherichia coli BL21 (eller DE3) celler og H1-uttrykkende bakterier ble lysert, hvoretter proteinet ble utsatt for kromatografisk analyse.

H1 ble krystallisert ved bruk av sittende dråpedampdiffusjonsteknikk og krystallene ble utsatt for røntgendiffraksjonsanalyse. H1-strukturen ble bestemt ved å bruke den molekylære erstatningsteknikken med vacciniavirus H1-strukturen som en søkemodell. En strukturell sammenligning med humane proteintyrosinfosfataser (PTP)/DSP-fosfataser ble deretter utført.

MPXV-H1-koordinater ble lastet opp til Dali-serveren og søkte etter lignende strukturerte proteiner i PDB (proteindatabase) ved å bruke PDB50-undergruppen. Som et resultat ble strukturer på 30 fosfataser med betydelig strukturell likhet identifisert (Z-score >13). Blant dem ble to humane fosfataser krystallisert som dimerer: human dual-spesifisitet fosfatase (hDSP)-5 og 27, og deres dimeriseringsmoduser ble sammenlignet.

Resultater

MPXV H1 omfattet 171 rester med veltilpassede elektrontettheter, ett asymmetrisk H1-molekyl og to symmetrisk justerte H1-molekyler, og dannet sommerfuglformede og domenebyttede dimerer. Hele H1-strukturen besto av henholdsvis seks og fire alfa-helikser (α) og beta-tråder (β), med et β-ark anordnet på sidene mellom heliksene α2 og α3 til α6.

De to aktive stedene var lokalisert i en avstand på 39 Å nær C-terminalene til den terminale β-strengen. Hvert aktivt sted omfattet en cystein (Cys)-arginin (Arg)-asparaginsyre (Asp) triade. I hvert aktivt sete var de konserverte Arg- og Cys-restene lokalisert i fosfation-bindingssløyfen mellom α4- og β4-restene. Arg116-resten av løkken fanget fosfationer hvis guanidiniumgruppe interagerte med to PO (fosfat-oksygen) molekyler forbundet med hydrogenbindinger.

Arg116-resten sørget for effektiv substratorientering og binding. De N-terminale α1-heliksene til hver protomer ble byttet ut for å mediere H1-dimeriseringer. α1-heliksene til en enkelt H1-protomer dannet en buntet struktur med tre α4 til α6-helikser av de tilsvarende promotorene involvert i paring. Ved bunnen av den katalytiske lommen angrep Cys110-resten fosforatomer under defosforylering, noe som resulterte i forbigående dannelse av et enzym-fosfat-mellomprodukt, som ble hydrolysert for å regenerere uorganisk fosfat og enzym.

Svovelatomet til Cys110-resten ble plassert parallelt med PO-bindingen, som tilsvarer bindingen dannet ved regenerering av enzymet. Asp79-resten var involvert i koordinering med vannmolekylet og fungerte som en syre, noe som letter dannelsen og hydrolysen av mellomproduktet. H1-strukturen indikerte således det siste katalytiske trinnet før produktfrigjøring.

Overflaten begravd mellom to promotorer var 1000 Å2 fra hverandre og ble stabilisert ved hydrofobe og hydrofile interaksjoner. Serinrestene (Ser)14 og treoninrestene (Thr)15 i α1 viste henholdsvis hydrogenbindinger med histidinrester (His)143 og tyrosinrester (Tyr)142/lysinrester (Lys)159 av den tilsvarende H1-protomeren. I motsetning til dette deltok restene Tyr7, leucin (Leu)11 og Leu12 i hydrofobe bindinger med restene metionin (Met)135, Leu139, Lys159, isoleucin (Ile)163, valin (Val)167 og Ile168 fra H1-paringen.

Leu136-, Leu139- og Met135-restene i α5 ble motarbeidet av symmetriassosierte dimerrester for å utvide det hydrofobe bindingsgrensesnittet. α1-resten ble stabilisert ved bruk av hydrofobe interaksjoner og intramolekylære hydrogenbindinger mellom α1- og α5-restene. H1-dimeren ble bekreftet i kromatografisk analyse, noe som indikerer at dimerene representerte funksjonelle tilstander.

MPXV H1-krystallstrukturen avslørte to hotspots for utvikling av nye antivirale legemidler. Dimerkontaktstedet er et hotspot som er unikt for PTP/DSP-molekyler. Hemming av H1-dimerisering kan potensielt hemme dimeriseringen og defosforyleringen av den aktiverte STAT1-fosfor-tyrosin-homodimeren. Det andre hotspotet er det aktive stedet, som, selv om det er lokalisert rundt fosfation-bindingsløkkene med sammenlignbare ryggradsstrukturer, har forskjellige sidekjeder og derfor kan substratspesifisiteten endres, noe som baner vei for utvikling av antivirale medisiner.

Samlet sett avslørte studieresultatene den høyoppløselige H1-krystallstrukturen, som gir et solid grunnlag for videre mekanistisk analyse og utvikling av nye antivirale legemidler mot nye virale patogener.

Denne nyhetsartikkelen var en gjennomgang av en foreløpig vitenskapelig rapport som ikke hadde blitt fagfellevurdert på publiseringstidspunktet. Siden den første publiseringen har den vitenskapelige rapporten nå blitt fagfellevurdert og akseptert for publisering i et akademisk tidsskrift. Lenker til de foreløpige og fagfellevurderte rapportene finner du i Kilder-delen på slutten av denne artikkelen. Se kilder

Referanser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.