Analiza strukturalna podwójnej fosfatazy H1 wirusa ospy małpiej jako celu dla wirusa ospy ogólnej

Analiza strukturalna podwójnej fosfatazy H1 wirusa ospy małpiej jako celu dla wirusa ospy ogólnej

W niedawnym badaniu opublikowanym w bioRxiv * Serwer wydruku wstępnego: Naukowcy ustalili, że struktura krystaliczna podwójnie specyficznej fosfatazy H1 (DSP) wirusa ospy małpiej (MPXV) przy rozdzielczości 1,8 Å ma kluczowe znaczenie dla replikacji wirusa, co czyni go atrakcyjnym celem przeciwwirusowym.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Ten artykuł prasowy był recenzją wstępnego raportu naukowego, który nie był recenzowany w momencie publikacji. Od czasu pierwszej publikacji raport naukowy został poddany recenzji naukowej i zaakceptowany do publikacji w czasopiśmie akademickim. Linki do raportów wstępnych i recenzowanych można znaleźć w sekcji Źródła na końcu tego artykułu. Zobacz źródła

Liczba przypadków MPX na całym świecie stale rośnie z godziny na godzinę, co uzasadnia potrzebę opracowania skutecznych leków przeciwwirusowych i szczepionek w celu poprawy globalnej gotowości na MPX i powstrzymania infekcji wirusowych. H1 jest niezbędny do replikacji MPXV, ponieważ defosforyluje białka, takie jak A14, F18, A17 oraz przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 1 (STAT1) oraz hamuje sygnalizację interferonu (IFN). Co ważne, HI jest konserwatywny wśród wirusów ospy i dlatego może być celem opracowywania szeroko zakrojonych środków przeciwwirusowych.

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy zbadali strukturę kryształu H1 przy rozdzielczości 1,8 Å, aby lepiej zrozumieć defosforylację katalizowaną przez MPXV H1 i opracować precyzyjny model opracowywania nowych leków przeciwwirusowych.

Kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) kodujący H1 obecnego izolatu MPXV_USA_2022_MA001 z epidemii MPXV w 2022 r. zsyntetyzowano i sklonowano do wektora plazmidu ekspresyjnego, co zweryfikowano przez sekwencjonowanie. H1 ulegał ekspresji w komórkach Escherichia coli BL21 (lub DE3), a bakterie wyrażające H1 poddano lizie, po czym białko poddano analizie chromatograficznej.

H1 krystalizowano stosując technikę dyfuzji pary w siedzącej kropli, a kryształy poddano analizie dyfrakcji promieni rentgenowskich. Strukturę H1 określono stosując technikę zastępowania molekularnego, stosując strukturę H1 wirusa krowianki jako model poszukiwań. Następnie przeprowadzono porównanie strukturalne z ludzkimi białkowymi fosfatazami tyrozynowymi (PTP)/DSP.

Współrzędne MPXV-H1 przesłano na serwer Dali i przeszukano białka o podobnej strukturze w PDB (baza danych białek) przy użyciu podzbioru PDB50. W rezultacie zidentyfikowano struktury 30 fosfataz o znacznym podobieństwie strukturalnym (wynik Z-score > 13). Wśród nich dwie ludzkie fosfatazy skrystalizowały jako dimery: ludzka fosfataza o podwójnej specyficzności (hDSP)-5 i 27 i porównano tryby ich dimeryzacji.

Wyniki

MPXV H1 składał się ze 171 reszt o dobrze dobranych gęstościach elektronów, jednej asymetrycznej cząsteczki H1 i dwóch symetrycznie ustawionych cząsteczek H1, tworząc dimery w kształcie motyla i z zamienionymi domenami. Cała struktura H1 składała się odpowiednio z sześciu i czterech nici alfa (α) i beta (β), z arkuszem β rozmieszczonym po bokach pomiędzy helisami α2 i α3 do α6.

Dwa miejsca aktywne znajdowały się w odległości 39 Å w pobliżu końcówek C końcowej nici β. Każde miejsce aktywne zawierało triadę cysteina (Cys)-arginina (Arg)-kwas asparaginowy (Asp). W każdym miejscu aktywnym konserwatywne reszty Arg i Cys znajdowały się w pętli wiążącej jony fosforanowe pomiędzy resztami α4 i β4. Reszta Arg116 pętli wychwytuje jony fosforanowe, których grupa guanidyniowa oddziałuje z dwiema cząsteczkami PO (fosforan-tlen) połączonymi wiązaniami wodorowymi.

Reszta Arg116 zapewniała skuteczną orientację substratu i wiązanie. N-końcowe helisy α1 każdego protomeru wymieniono, aby pośredniczyć w dimeryzacji H1. Helisy α1 pojedynczego protomera H1 tworzyły strukturę wiązkową z trzema helisami α4 do α6 odpowiednich promotorów biorących udział w parowaniu. U podstawy kieszeni katalitycznej reszta Cys110 zaatakowała atomy fosforu podczas defosforylacji, powodując przejściowe utworzenie półproduktu enzym-fosforan, który został hydrolizowany w celu regeneracji nieorganicznego fosforanu i enzymu.

Atom siarki reszty Cys110 został umieszczony równolegle do wiązania PO, które odpowiada wiązaniu utworzonemu podczas regeneracji enzymu. Reszta Asp79 brała udział w koordynacji z cząsteczką wody i działała jak kwas, ułatwiając tworzenie i hydrolizę związku pośredniego. Zatem struktura H1 wskazywała ostatni etap katalityczny przed uwolnieniem produktu.

Powierzchnia ukryta pomiędzy dwoma promotorami była oddalona od siebie o 1000 Å2 i była stabilizowana przez oddziaływania hydrofobowe i hydrofilowe. Reszty seryny (Ser)14 i reszty treoniny (Thr)15 w α1 wykazywały wiązania wodorowe odpowiednio z resztami histydyny (His)143 i resztami tyrozyny (Tyr)142/resztami lizyny (Lys)159 odpowiedniego protomeru H1. Natomiast reszty Tyr7, leucyna (Leu)11 i Leu12 uczestniczyły w wiązaniach hydrofobowych z resztami metioniny (Met)135, Leu139, Lys159, izoleucyny (Ile)163, waliny (Val)167 i Ile168 z parowania H1.

Reszty Leu136, Leu139 i Met135 w α5 przeciwstawiono resztom dimeru związanym z symetrią, aby wydłużyć hydrofobową powierzchnię wiązania. Resztę α1 stabilizowano za pomocą oddziaływań hydrofobowych i wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych pomiędzy resztami α1 i α5. Dimer H1 potwierdzono analizą chromatograficzną, wskazując, że dimery reprezentują stany funkcjonalne.

Struktura krystaliczna MPXV H1 ujawniła dwa kluczowe punkty w opracowywaniu nowych leków przeciwwirusowych. Miejsce kontaktu dimeru jest punktem aktywnym unikalnym dla cząsteczek PTP/DSP. Hamowanie dimeryzacji H1 może potencjalnie hamować dimeryzację i defosforylację aktywowanego homodimeru fosfor-tyrozyna STAT1. Drugim gorącym punktem jest miejsce aktywne, które chociaż znajduje się wokół pętli wiążących jony fosforanowe o porównywalnych strukturach szkieletu, ma różne łańcuchy boczne, w związku z czym specyficzność substratowa może ulec zmianie, torując drogę do opracowania leków przeciwwirusowych.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badania ujawniły strukturę krystaliczną H1 o wysokiej rozdzielczości, co stanowi solidną podstawę do dalszej analizy mechanistycznej i opracowania nowych leków przeciwwirusowych przeciwko pojawiającym się patogenom wirusowym.

Ten artykuł prasowy był recenzją wstępnego raportu naukowego, który nie był recenzowany w momencie publikacji. Od czasu pierwszej publikacji raport naukowy został poddany recenzji naukowej i zaakceptowany do publikacji w czasopiśmie akademickim. Linki do raportów wstępnych i recenzowanych można znaleźć w sekcji Źródła na końcu tego artykułu. Zobacz źródła

Referencje:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.