Análise estrutural da fosfatase dupla H1 do vírus da varíola dos macacos como alvo do pan-poxvírus

Análise estrutural da fosfatase dupla H1 do vírus da varíola dos macacos como alvo do pan-poxvírus

Num estudo recente publicado em bioRxiv * Servidor de pré-impressão: Os pesquisadores determinaram que a estrutura cristalina da fosfatase H1 (DSP) de dupla especificidade do vírus da varíola dos macacos (MPXV) com resolução de 1,8 Å é crítica para a replicação do vírus, tornando-o um alvo antiviral atraente.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

O número de casos de MPX continua a aumentar a cada hora em todo o mundo, justificando a necessidade do desenvolvimento de terapêuticas antivirais e vacinas eficazes para melhorar a preparação global para a MPX e conter infecções virais. H1 é essencial para a replicação do MPXV, pois desfosforila proteínas como A14, F18, A17 e transdutor de sinal e ativador da transcrição 1 (STAT1) e inibe a sinalização do interferon (IFN). É importante ressaltar que o HI é conservado entre os poxvírus e pode, portanto, ser direcionado para o desenvolvimento de amplos agentes antivirais.

Sobre o estudo

No presente estudo, os pesquisadores examinaram a estrutura cristalina H1 com resolução de 1,8 Å para melhorar a compreensão da desfosforilação catalisada por MPXV H1 e para desenvolver um modelo preciso para o desenvolvimento de novos medicamentos antivirais.

O ácido desoxirribonucléico (DNA) que codifica H1 do atual surto de MPXV de 2022, isolado MPXV_USA_2022_MA001, foi sintetizado e clonado em um vetor plasmídico de expressão, que foi verificado por sequenciamento. H1 foi expresso em células de Escherichia coli BL21 (ou DE3) e as bactérias que expressam H1 foram lisadas, após o que a proteína foi submetida a análise cromatográfica.

H1 foi cristalizado usando a técnica de difusão de vapor em gotas e os cristais foram submetidos à análise de difração de raios X. A estrutura H1 foi determinada utilizando a técnica de substituição molecular com a estrutura H1 do vírus vaccinia como modelo de pesquisa. Uma comparação estrutural com proteínas tirosina fosfatases humanas (PTP)/DSP fosfatases foi então realizada.

As coordenadas MPXV-H1 foram carregadas no servidor Dali e pesquisadas por proteínas estruturadas de forma semelhante no PDB (banco de dados de proteínas) usando o subconjunto PDB50. Como resultado, foram identificadas estruturas de 30 fosfatases com similaridade estrutural significativa (escores Z> 13). Entre elas, duas fosfatases humanas foram cristalizadas como dímeros: fosfatase humana de dupla especificidade (hDSP) -5 e 27, e seus modos de dimerização foram comparados.

Resultados

MPXV H1 compreendia 171 resíduos com densidades eletrônicas bem combinadas, uma molécula H1 assimétrica e duas moléculas H1 simetricamente alinhadas, formando dímeros em forma de borboleta e com domínios trocados. Toda a estrutura H1 consistia em seis e quatro hélices alfa (α) e fitas beta (β), respectivamente, com uma folha β disposta nas laterais entre as hélices α2 e α3 a α6.

Os dois sítios ativos estavam localizados a uma distância de 39 Å perto dos terminais C da cadeia β terminal. Cada sítio ativo compreendia uma tríade cisteína (Cys)-arginina (Arg)-ácido aspártico (Asp). Em cada sítio ativo, os resíduos conservados de Arg e Cys estavam localizados na alça de ligação do íon fosfato entre os resíduos α4 e β4. O resíduo Arg116 da alça capturou íons fosfato cujo grupo guanidínio interagiu com duas moléculas PO (fosfato-oxigênio) conectadas por ligações de hidrogênio.

O resíduo Arg116 garantiu orientação e ligação eficiente do substrato. As hélices α1 N-terminais de cada protômero foram trocadas para mediar as dimerizações H1. As hélices α1 de um único protômero H1 formaram uma estrutura agrupada com três hélices α4 a α6 dos promotores correspondentes envolvidos no emparelhamento. Na base da bolsa catalítica, o resíduo Cys110 atacou os átomos de fósforo durante a desfosforilação, resultando na formação transitória de um intermediário enzima-fosfato, que foi hidrolisado para regenerar o fosfato inorgânico e a enzima.

O átomo de enxofre do resíduo Cys110 foi posicionado paralelamente à ligação PO, que corresponde à ligação formada na regeneração da enzima. O resíduo Asp79 esteve envolvido em coordenação com a molécula de água e atuou como ácido, facilitando a formação e hidrólise do intermediário. Assim, a estrutura H1 indicou a última etapa catalítica antes da liberação do produto.

A superfície enterrada entre dois promotores estava separada por 1000 Å2 e foi estabilizada por interações hidrofóbicas e hidrofílicas. Os resíduos de serina (Ser) 14 e resíduos de treonina (Thr) 15 em α1 apresentaram ligações de hidrogênio com resíduos de histidina (His) 143 e resíduos de tirosina (Tyr) 142/resíduos de lisina (Lys) 159 do protômero H1 correspondente, respectivamente. Em contraste, os resíduos Tyr7, leucina (Leu)11 e Leu12 participaram de ligações hidrofóbicas com os resíduos metionina (Met)135, Leu139, Lys159, isoleucina (Ile)163, valina (Val)167 e Ile168 do emparelhamento H1.

Os resíduos Leu136, Leu139 e Met135 em α5 foram combatidos por resíduos de dímeros associados à simetria para estender a interface de ligação hidrofóbica. O resíduo α1 foi estabilizado utilizando interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio intramoleculares entre os resíduos α1 e α5. O dímero H1 foi confirmado na análise cromatográfica, indicando que os dímeros representavam estados funcionais.

A estrutura cristalina do MPXV H1 revelou dois pontos críticos para o desenvolvimento de novos medicamentos antivirais. O local de contato do dímero é um ponto de acesso exclusivo para moléculas de PTP/DSP. A inibição da dimerização H1 poderia potencialmente inibir a dimerização e desfosforilação do homodímero fósforo-tirosina STAT1 ativado. O segundo hotspot é o sítio ativo, que, embora localizado em torno das alças de ligação do íon fosfato com estruturas comparáveis, possui cadeias laterais diferentes e, portanto, a especificidade do substrato pode ser alterada, abrindo caminho para o desenvolvimento de medicamentos antivirais.

No geral, os resultados do estudo revelaram a estrutura cristalina H1 de alta resolução, que fornece uma base sólida para análises mecanísticas adicionais e desenvolvimento de novos medicamentos antivirais contra patógenos virais emergentes.

Esta notícia foi uma revisão de um relatório científico preliminar que não havia sido revisado por pares no momento da publicação. Desde a sua publicação inicial, o relatório científico foi agora revisto por pares e aceite para publicação numa revista académica. Links para os relatórios preliminares e revisados ​​por pares podem ser encontrados na seção Fontes no final deste artigo. Ver fontes

Referências:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.