Strukturell analys av appoxvirus H1 dubbelt fosfatas som ett panpoxvirusmål

Strukturell analys av appoxvirus H1 dubbelt fosfatas som ett panpoxvirusmål

I en nyligen publicerad studie publicerad i bioRxiv * Preprint-server: Forskare fastställde att kristallstrukturen hos appoxvirus (MPXV) dubbelspecifikt H1-fosfatas (DSP) vid 1,8 Å-upplösning är avgörande för virusreplikering, vilket gör det till ett attraktivt antiviralt mål.

Lernen: Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. Bildnachweis: Die Fuchswerkstatt/Shutterstock

Den här nyhetsartikeln var en recension av en preliminär vetenskaplig rapport som inte hade granskats av experter vid tidpunkten för publiceringen. Sedan den första publiceringen har den vetenskapliga rapporten nu granskats och godkänts för publicering i en akademisk tidskrift. Länkar till de preliminära och expertgranskade rapporterna finns i avsnittet Källor i slutet av den här artikeln. Visa källor

Antalet MPX-fall fortsätter att öka varje timme över hela världen, vilket motiverar behovet av utveckling av effektiva antivirala läkemedel och vacciner för att förbättra den globala beredskapen för MPX och innehålla virusinfektioner. H1 är avgörande för MPXV-replikation eftersom det defosforylerar proteiner som A14, F18, A17 och signalomvandlare och aktivator av transkription 1 (STAT1) och hämmar interferon (IFN) signalering. Viktigt är att HI bevaras bland poxvirus och kan därför riktas mot utvecklingen av breda antivirala medel.

Om studien

I den aktuella studien undersökte forskarna H1-kristallstrukturen vid 1,8 Å-upplösning för att förbättra förståelsen av MPXV H1-katalyserad defosforylering och för att utveckla en exakt modell för utveckling av nya antivirala läkemedel.

Deoxiribonukleinsyran (DNA) som kodar för H1 från det aktuella MPXV-utbrottet MPXV_USA_2022_MA001-isolatet 2022 syntetiserades och klonades in i en expressionsplasmidvektor, som verifierades genom sekvensering. H1 uttrycktes i Escherichia coli BL21 (eller DE3)-celler och H1-uttryckande bakterier lyserades, varefter proteinet utsattes för kromatografisk analys.

H1 kristalliserades med användning av sittande dropp-ångdiffusionsteknik och kristallerna utsattes för röntgendiffraktionsanalys. Hl-strukturen bestämdes med användning av den molekylära ersättningstekniken med vacciniavirus H1-strukturen som en sökmodell. En strukturell jämförelse med humana proteintyrosinfosfataser (PTP)/DSP-fosfataser utfördes sedan.

MPXV-H1-koordinater laddades upp till Dali-servern och sökte efter liknande strukturerade proteiner i PDB (proteindatabasen) med hjälp av PDB50-underuppsättningen. Som ett resultat identifierades strukturer av 30 fosfataser med signifikant strukturell likhet (Z-poäng >13). Bland dem kristalliserades två humana fosfataser som dimerer: humant fosfatas med dubbel specificitet (hDSP)-5 och 27, och deras dimeriseringssätt jämfördes.

Resultat

MPXV H1 bestod av 171 rester med väl matchade elektrondensiteter, en asymmetrisk H1-molekyl och två symmetriskt inriktade H1-molekyler, som bildar fjärilsformade och domänbytta dimerer. Hela H1-strukturen bestod av sex och fyra alfaspiraler (α) respektive betasträngar (β), med ett β-ark anordnat på sidorna mellan helixarna α2 och α3 till α6.

De två aktiva platserna var belägna på ett avstånd av 39 Å nära C-terminalerna av den terminala β-strängen. Varje aktiv plats bestod av en cystein (Cys)-arginin (Arg)-asparaginsyra (Asp) triad. I varje aktivt ställe var de konserverade Arg- och Cys-resterna lokaliserade i fosfatjonbindningsslingan mellan α4- och β4-resterna. Arg116-resten av slingan fångade fosfatjoner vars guanidiniumgrupp interagerade med två PO (fosfat-syre)-molekyler förbundna med vätebindningar.

Arg116-resten säkerställde effektiv substratorientering och bindning. De N-terminala al-helixarna för varje protomer utbyttes för att förmedla H1-dimeriseringar. α1-spiralerna hos en enda H1-protomer bildade en buntad struktur med tre α4- till α6-helixar av motsvarande promotorer involverade i parning. Vid basen av den katalytiska fickan attackerade Cys110-resten fosforatomer under defosforylering, vilket resulterade i övergående bildning av en enzym-fosfat-mellanprodukt, som hydrolyserades för att regenerera oorganiskt fosfat och enzym.

Svavelatomen i Cys110-resten placerades parallellt med PO-bindningen, vilket motsvarar den bindning som bildas vid regenerering av enzymet. Asp79-resten var involverad i koordinering med vattenmolekylen och fungerade som en syra, vilket underlättade bildningen och hydrolysen av mellanprodukten. Således indikerade Hl-strukturen det sista katalytiska steget före produktfrisättning.

Ytan som begravdes mellan två promotorer var 1000 Å2 från varandra och stabiliserades genom hydrofoba och hydrofila interaktioner. Serinresterna (Ser)14 och treoninresterna (Thr)15 i al visade vätebindningar med histidinrester (His)143 respektive tyrosinrester (Tyr)142/lysinrester (Lys)159 av motsvarande Hl-protomer. Däremot deltog resterna Tyr7, leucin (Leu)11 och Leu12 i hydrofoba bindningar med resterna metionin (Met)135, Leu139, Lys159, isoleucin (Ile)163, valin (Val)167 och Ile168 från H1-parningen.

Leu136-, Leu139- och Met135-resterna i a5 var motsatta av symmetriassocierade dimerrester för att förlänga den hydrofoba bindningsgränsytan. Al-resten stabiliserades med användning av hydrofoba interaktioner och intramolekylära vätebindningar mellan al- och a5-resterna. Hl-dimeren bekräftades i kromatografisk analys, vilket indikerar att dimererna representerade funktionella tillstånd.

MPXV H1-kristallstrukturen avslöjade två hotspots för utvecklingen av nya antivirala läkemedel. Dimerkontaktplatsen är en hotspot unik för PTP/DSP-molekyler. Hämning av H1-dimerisering kan potentiellt hämma dimeriseringen och defosforyleringen av den aktiverade STAT1-fosfortyrosinhomodimeren. Den andra hotspoten är det aktiva stället, som, även om det är beläget runt fosfatjonbindningsslingorna med jämförbara ryggradsstrukturer, har olika sidokedjor och därför kan substratspecificiteten ändras, vilket banar väg för utveckling av antivirala läkemedel.

Sammantaget avslöjade studieresultaten den högupplösta H1-kristallstrukturen, som ger en solid grund för ytterligare mekanistisk analys och utveckling av nya antivirala läkemedel mot nya virala patogener.

Den här nyhetsartikeln var en recension av en preliminär vetenskaplig rapport som inte hade granskats av experter vid tidpunkten för publiceringen. Sedan den första publiceringen har den vetenskapliga rapporten nu granskats och godkänts för publicering i en akademisk tidskrift. Länkar till de preliminära och expertgranskade rapporterna finns i avsnittet Källor i slutet av den här artikeln. Visa källor

Referenser:

• Vorläufiger wissenschaftlicher Bericht.
  Wen Cui et al. (2022). Kristallstruktur der Affenpocken-H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.09.30.510410 https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.30.510410v1
• Von Experten begutachteter und veröffentlichter wissenschaftlicher Bericht.
  Cui, Wen, Haojun Huang, Yinkai Duan, Zhi Luo, Haofeng Wang, Tenan Zhang, Henry C Nguyen, et al. 2022. „Kristallstruktur der Monkeypox H1-Phosphatase, einem antiviralen Wirkstoffziel.“ Protein & Zelle, November. https://doi.org/10.1093/procel/pwac051. https://academic.oup.com/proteincell/advance-article/doi/10.1093/procel/pwac051/6805938.

.