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Neuartige Methode nutzt Nanoporenpinzetten, um die Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase bei Einzelnukleotidauflösung zu erleichtern


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In einer aktuellen Studie, die im veröffentlicht wurde bioRxiv* Preprint-Server: Forscher visualisierten den Wirk- und Hemmmechanismus des nichtstrukturellen Proteins 13 (NSP13) des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung.

Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung.  Bildnachweis: atdigit/Shutterstock
Studie: Hemmung der SARS-CoV-2-Helikase mit Einzelnukleotidauflösung. Bildnachweis: atdigit/Shutterstock

*Wichtiger Hinweis: bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Experten begutachtet werden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, als Leitfaden für die klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten dienen oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Hintergrund

Von allen 15 SARS-COV-2-NSPs ist NSP13, eine Ribonukleinsäure (RNA)-Helikase, entscheidend für seine Replikation. Allerdings gibt es derzeit keine zugelassenen antiviralen Medikamente, die auf NSP13 abzielen. Im Gegensatz zu SARS-CoV-2-Strukturproteinen ist die Aminosäuresequenz von nsp13 eine der am besten konservierten unter vielen Arten von Coronaviren (CoV) (z. B. Middle Eastern Respiratory Syndrome CoV) und besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten (VOCs). einschließlich Omicron. Zusammengenommen macht dies nsp13 zu einem attraktiven antiviralen Breitbandziel mit dem Potenzial, künftige CoV-Ausbrüche zu bekämpfen.

Struktur- und biochemische Studien haben gezeigt, dass es sich bei nsp13 um eine RNA-Helikase der Superfamilie 1B (SF1B) handelt. Es nutzt einen Inchworm-Mechanismus für die Translokation entlang einzelsträngiger (ss) Nukleinsäure (NA)-Substrate, durch den nsp13 wahrscheinlich NA-Duplexe abwickelt. Aufgrund seiner geringen Schrittgröße war es mit Einzelmolekültechniken nicht möglich, die Geschwindigkeit zu entschlüsseln, mit der sich nsp13 entlang seines NA-Substrats bewegt. Eine solche Auflösung könnte Aufschluss darüber geben, wie hemmende Moleküle ihre Wirkungsweise beeinflussen.

Über die Studie

In der vorliegenden Studie entwickelten die Forscher eine Einzelmolekül-Pikometer-Auflösungs-Nanoporenpinzette (SPRNT), um die Schritte der SARS-CoV-2-nsp13-Bewegung auf DNA-Strängen zu messen. Darüber hinaus zeigten sie, wie SPRNT verwendet werden kann, um den Wirkungsmechanismus eines Helikase-Inhibitors zu bestimmen. Das Team entwarf eine einzelne Nanopore von Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) innerhalb einer Phospholipid-Doppelschicht. Eine an diese Membran angelegte Spannung ließ einen Ionenstrom durch die Nanopore fließen, der negativ geladenes NA durch die Pore zog.

Verschiedene NA-Basen innerhalb der Nanopore verursachten einzigartige Ionenstromblockaden, die in die NA-Sequenz entschlüsselt werden konnten. Eine an den eingefangenen NA-Strang gebundene Helikase kommt am Porenrand zur Ruhe und zieht die NA, was zu aufeinanderfolgenden Ionenstromschritten führt. Das Team löste diese in Einzelnukleotidschritte auf Zeitskalen im Submillisekundenbereich auf, um die Bewegung der Helikase entlang der NA zu beobachten. Gleichzeitig bestimmten sie die NA-Sequenz des Substrats in der Helikase.

Es ist auch bemerkenswert, dass SPRNT eine Kraft proportional zur angelegten Spannung auf den Enzym/NA-Komplex ausübte, die die Bewegung von nsp13 unterstützte oder widerstand, je nachdem, an welches Ende der Nanopore NA gebunden war. Darüber hinaus beobachtete das Team die Bewegung von NSP13 entlang NAs in Gegenwart des Adenosintriphosphatase (ATPase)-Inhibitors ATPγS.

Studienergebnisse

Die Forscher zeichneten 2413 einzelne NSP13-Translokations- und Entwindungsereignisse und 27.641 Helikaseschritte auf. Die Studienergebnisse bestätigten, dass NSP13 mit etwa 1000 Nukleotiden pro Sekunde entlang ssDNA- und abgewickelten DNA-Duplexen mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Basenpaaren pro Sekunde translozierte. Die NSP13-Translokationsrate war ATP-abhängig, wobei die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) zwischen 600 und 3000 s−1 und die Michaelis-Konstante (Km) zwischen 100 und 700 µM für ATP lag, abhängig vom zugrunde liegenden Sequenzkontext innerhalb von NSP13. Solche großen Unterschiede in den Translokationsraten an verschiedenen DNA-Positionen deuteten darauf hin, dass die NA-Basenidentität die NSP13-Translokationskinetik beeinflusste.

Die Studienergebnisse zeigten auch, dass der NSP13-DNA-Komplex weniger stabil war und sich durch Krafteinwirkung leichter lösen ließ. Das Variieren der unterstützenden Kraft von ~24 PicoNewton (pN) auf ~44 pN bei gesättigtem ATP verursachte keine deutliche Änderung der durchschnittlichen Translokationsgeschwindigkeit von NSP13. Darüber hinaus deutete dies darauf hin, dass es sich bei der NSP13-Translokation überwiegend um eine ATP-Hydrolyse-getriebene Bewegung handelte.

Die Autoren stellten außerdem fest, dass die Schritte zum Abwickeln des dsDNA-Duplexes (im Durchschnitt) fast achtmal länger waren als die der ssDNA-Translokation. Darüber hinaus war das Abwickeln der dsDNA langsamer als die Translokation der ssDNA, obwohl ihre Verweilzeiten korrelierten. Ein ähnlicher Effekt wurde in einer anderen Studie beobachtet, in der die SF1A-Helikase PcrA mithilfe von SPRNT untersucht wurde. Interessanterweise bilden die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) von SARS-CoV-2 und NSP13 einen Komplex mit etwa 170 nt/s bei 37 °C, ähnlich dem, was mit SPRNT als NSP13-Abwickelgeschwindigkeit beobachtet wurde.

Darüber hinaus stellten die Autoren fest, dass ATPγS die Wirkung von NSP13 über mehrere verschiedene kinetische Prozesse beeinträchtigte. Der vorherrschende Mechanismus hing jedoch von der Anwendung unterstützender Kraft ab. Obwohl ATPγS kein brauchbarer Medikamentenkandidat für NSP13 ist, zeigte es die Leistungsfähigkeit von SPRNT bei der Untersuchung der Mechanismen der Helikase-Hemmung. Es wurden drei Methoden der NSP13-Hemmung identifiziert:

i) Reduzierung seiner Prozessivität,

ii) Verhinderung der Verbindung seiner Domänen 1A und 2A nach der Nukleotidbindung und

iii) Verlangsamung der ATPγS-Hydrolyse im Vergleich zu ATP.

Schlussfolgerungen

Insgesamt wurde in der Studie SPRNT als wertvolles und leistungsstarkes Instrument zur Untersuchung der Rolle von NSP13 innerhalb des Replikations- und Transkriptionskomplexes (RTC) von SARS-CoV-2 hervorgehoben. Die SPRNT-Methode zeigte auch eine überlegene Fähigkeit, die Untersuchung der Kinetik der NSP13-Translokation oder einer beliebigen Helikase zu erleichtern, selbst ohne Duplex. Darüber hinaus könnten SPRNT-Experimente die Untersuchung von NSP13 an nativen SARS-CoV-2-Sequenzen erleichtern, um Aufschluss über spezifische Sequenzelemente des hochstrukturierten SARS-CoV-2-Genoms und ihre Rolle bei der NSP13-Regulation zu geben.

*Wichtiger Hinweis: bioRxiv veröffentlicht vorläufige wissenschaftliche Berichte, die nicht von Experten begutachtet werden und daher nicht als schlüssig angesehen werden sollten, als Leitfaden für die klinische Praxis/gesundheitsbezogenes Verhalten dienen oder als etablierte Informationen behandelt werden sollten.

Referenz:


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Daniel Wom

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