Es wurde festgestellt, dass die ultralange komplementaritätsbestimmende Region H3 von Rindern mit Sarbecoviren kreuzreagiert

In einer kürzlich veröffentlichten Studie in der Zeitschrift für biologische ChemieForscher führten eine In-vitro-Analyse durch, um ultralange bovine schwere Ketten zu isolieren, die eine Bindung mit dem schweren akuten respiratorischen Syndrom-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) und verwandten Coronaviren (CoVs) zeigten.

Studie: Ein boviner Antikörper, der über eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region CDRH3 verfügt, zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. Bildnachweis: Andrii Yarovsky/Shutterstock

Hintergrund

Studien haben gezeigt, dass breit neutralisierende Antikörper (Abs) aufgrund ihrer Fähigkeit, hochkonservierte Epitope zu identifizieren, die in Virusvarianten selten mutiert sind, ein enormes Potenzial als antivirale Therapeutika haben. Eine bovine Ab-Untergruppe besitzt eine ultralange komplementaritätsbestimmende Region (CDR)H3, die sich hervorragend für die Identifizierung konservierter viraler Epitope eignet; Ihre Aktivität gegen Sarbecovirus-Spike (S)-Proteine ​​ist jedoch nicht gut charakterisiert und erfordert weitere Untersuchungen.

Über die Studie

In der vorliegenden Proof-of-Principle-Studie zielten die Forscher darauf ab, ultralange bovine schwere Ketten zu isolieren, die in vitro an Sarbecovirus-S-Proteine ​​binden könnten.

Zum Screening ultralanger CDRH3-Ab-Bibliotheken wurde ein Säugetierzelloberflächen-Screening verwendet. Die variablen Exons der Leukozyten-gDNA (genomische Desoxyribonukleinsäure) von Kühen wurden amplifiziert, um eine Bibliothek ultralanger boviner Paratope zu erzeugen. Anschließend wurde eine Anreicherung der ultralangen CDRH3-Regionen durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Größenauswahl durchgeführt, um eine Bibliothek mit ultralangen CDRH3s zu erstellen.

Als nächstes fügte das Team die Amplifikate in die pBovShow-Kassette ein. Es untersuchte die Proteinbibliothek des ultralangen variablen Einzelkettenfragments (scFv), um die S-Bindung von SARS-CoV-2 zu identifizieren, indem die scFv-Bibliothek vorübergehend in die 293T-Zellen transfiziert und eine FC-Analyse durchgeführt wurde. Um die Effizienz der S-bindenden scFv(s)-Isolierung zu erhöhen, wurde die Bibliothek in LV-Vektoren (Lentivirus) kloniert und mit dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV) pseudotypisierte LV-Partikel erzeugt und in den 293T-Zellen transduziert, um kombinierte scFv-Sequenzen für jede Zelle zu erhalten.

Insgesamt 15 SCCs (Einzelzellklone) zeigten S-Interaktion, von denen drei drei scFvs mit einer identischen Nukleotidsequenz enthielten, die als B9-scFv bezeichnet wurde. Um das Epitop von B9-scFv zu lokalisieren, wurden die S-Untereinheiten, die S1-, S2- und S1-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) von SARS-CoV-2 mithilfe der IMAC-Analyse (immobilisierte Metallaffinitätschromatographie) gereinigt. Zur Untersuchung des Mechanismus der Antikörperbindung wurde eine differenzielle Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (MS) durchgeführt.

Ergebnisse

Ein breit reaktives und ein ultralanges scFv (B9-scFv) CDRH3-Epitop wurde aus einer SARS-CoV-2-naiven Schwerkettenbibliothek isoliert, die eine Bindung an SARS-CoV-2 RBD zeigte, alle besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten ( VOCs) und SARS-CoV RBD. Das Epitop neutralisierte SARS-CoV-S-pseudotypisierte Viren, jedoch nicht durch Konkurrenz mit der ACE2-Rezeptorbindung (Angiotensin-Converting-Enzym 2).

Vielmehr neutralisierte das Epitop pseudotypisierte SARS-CoV-LVs, die vorübergehend über S-Protein-Bewegungen zwischen Domänen verfügbar waren und den Präfusionskomplex destabilisierten. Das Epitop lokalisierte sich in einer kryptischen Spalte auf der Innenfläche des RBD, einer Stelle, die sich mit Fußabdrücken einiger weniger breiter Anti-SARS-CoV-2-Abs wie S2H97, 7D6/6D6 und FD20 überlappte.

Das breit aktive CDRH3 wurde aus einer bescheidenen Sequenzdiversitätsbibliothek isoliert, was das enorme Potenzial des Rindersystems als Quelle für die Gewinnung breit aktiver Abs unterstreicht, die Schutz gegen neue pathogene Organismen und ihre mutierten Varianten bieten können. B9-scFv umfasste 53 % der aus LV-transduzierten 293T-Zellen erhaltenen scFvs nach einer einzelnen S-Protein-Bindungsselektion, die bei weiterer FC-Anreicherung auf 83 % anstieg. Die Ergebnisse zeigten, dass B9-scFv größtenteils für die Anti-S-Aktivität in der Bibliothek verantwortlich war.

Zellen, die B9-scFv vorübergehend exprimierten, zeigten eine Bindung an S, RBD und S1, jedoch nicht an S2, was darauf hinweist, dass die B9-scFv-Bindungsstelle am RBD-Aminosäurerest 319 bis 591 lokalisiert war. Die Bindung von B9-scFv an S-Protein -transfizierte Zellen waren konzentrationsabhängig und im Vergleich zu ultralangen scFv-Kontrollen angereichert.

Bemerkenswert ist, dass B9-scFv keine Reaktivität mit nicht transfizierten Zellen zeigte, selbst bei Konzentrationen von fünf mM über eine Stunde, was ein starker Hinweis auf eine spezifische S-Ab-Wechselwirkung ist. Die B9-scFv-S-Bindung wurde über Mutationen wie N501Y, D614G, Y453F, E484K, K417N und L452R in SARS-CoV-2-VOCs wie Beta, Alpha, Delta, Gamma, Omicron und Gamma aufrechterhalten. Die Ergebnisse deuteten auf eine breite Kreuzreaktivität zwischen B9 und scFv hin.

Die Bindungsaffinität zu SARS-CoV-2-Varianten-RBDs war im Vergleich zum Wildtyp (wt) S vergleichbar, was die Beobachtung der B9-scFv-Bindung an ein stark zielgerichtetes und konserviertes Epitop untermauert. Auf SARS ausgerichtete humane CR3022-scFv und B9-scFv reagierten relativ wenig mit dem Middle East Respiratory Syndrome CoV (MERS-CoV) RBD, was darauf hindeutet, dass B9-scFv SARS-CoV-spezifisch war.

Bei der B9-scFv-Bindung an 200 nM und 2,0 μM SARS-CoV RBD wurde nur ein geringfügiger Unterschied beobachtet, was auf eine nanomolare Bindungsaffinität hinweist. B9-scFv neutralisierte nahezu vollständig (98 %) mit SARS-CoV S (Urbani-Stamm) pseudotypisierte LV-Partikel bei einer Konzentration von 70 μg/ml, zeigte jedoch bei äquivalenten SARS-CoV-2-Titern keine derartigen Effekte. Der halbmaximale Hemmkonzentrationswert (IC50) für die pseudotypisierte SARS-CoV-LV-Neutralisierung durch B9-scFv betrug 468 nM.

Insgesamt verdeutlichten die Studienergebnisse das Potenzial von in vitro exprimierten bovinen Abs mit ultralangen CDRH3s zur Isolierung neuartiger und breit wirksamer Therapeutika zur Bekämpfung neu auftretender pathogener Organismen und ihrer Varianten sowie zur Identifizierung erstklassiger Epitope für die Entwicklung von Impfstoffen. Das Team untermauerte zuvor veröffentlichte Erkenntnisse, dass sich ultralange CDRH3-Regionen mit relativ unveränderlichen Vλ-Leichtketten paaren, um eine scFv-Matrize zu erzeugen, auf der Bibliotheken ultralanger Schwerketten kloniert und exprimiert werden können.

Referenz:

• Burke MJ, Scott JNF, Minshull TC, Gao Z, Manfield I, Savic S, Stockley PG, Calabrese AN, Boyes J, Ein boviner Antikörper mit einer ultralangen komplementaritätsbestimmenden Region CDRH3 zielt auf ein hochkonserviertes Epitop in Sarbecovirus-Spike-Proteinen ab. (2022). Journal of Biological Chemistr. doi: https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.102624 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822010675