Hefedisplay zur Erzeugung SARS-CoV-2 RBD-spezifischer Nanokörper

In einer aktuellen Studie veröffentlicht in iScienceForscher haben biparatopische Nanokörper gegen das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) entwickelt.

Studie: Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2. Bildnachweis: Juan Gaertner/Shutterstock

Hintergrund

Trotz der rasanten Entwicklung wirksamer und sicherer Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 bleiben Fragen hinsichtlich ihrer langfristigen Wirksamkeit bestehen, was die fortgesetzte Suche nach neuen Therapiestrategien rechtfertigt. Rekombinante Protein-Biologika wie monoklonale Antikörper (mAbs) bieten Potenzial für die Prophylaxe und Behandlung infizierter Personen.

Darüber hinaus sind Nanokörper, Antikörper, die eine einzelne variable Domäne enthalten, in der Familie der Kameliden beheimatet. Die geringe Größe, hohe Stabilität und einfache Architektur von Nanokörpern sind gegenüber herkömmlichen mAbs von Vorteil. Diese ermöglichen eine verbesserte Penetration in Gewebe und neigen zur hochaffinen Bindung an kleine Epitope. Darüber hinaus können Nanokörper zur Funktionsverbesserung kovalent verknüpft werden und weisen typischerweise höhere Ausbeuten und niedrigere Produktionskosten auf.

Die Studie und Ergebnisse

In der vorliegenden Studie isolierten Forscher mithilfe einer synthetischen Hefe-Display-Bibliothek Nanokörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des SARS-CoV-2-Spikes. RBDs wurden in zwei Formaten hergestellt – 1) RBD-Monomer mit einem AVI-Tag für die Biotinylierung und 2) dimeres RBD-Fc, bei dem das RBD mit der fragmentkristallisierbaren (Fc) Domäne von Maus-IgG1 fusioniert wurde.

Die RBD-Sonden wurden durch vorübergehende Transfektion von 293T-Zellen mit humanem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) validiert und mit tetramerisierten RBD-Monomeren angefärbt. Die Autoren stellten eine ACE2-abhängige Bindung von RBD-Sonden an 293T-Zellen fest und bestätigten so deren funktionelle Integrität. Diese Tetramere wurden zur Erzeugung von RBD-spezifischen neutralisierenden Nanokörpern aus einer Hefe-Display-Bibliothek verwendet.

Die Selektion umfasste zwei aufeinanderfolgende magnetische Anreicherungsschritte, gefolgt von einer auf fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) basierenden Anreicherung, die zu einer Bibliothek mit etwa 72 % RBD-bindenden Hefeklonen führte. Als nächstes wurde die Bibliothek gemeinsam mit RBD-Tetrameren von SARS-CoV-1 und SARS-CoV-2 gefärbt, was unterschiedliche Populationen ergab.

Eine Population (Hauptpopulation) band ausschließlich SARS-CoV-2-RBD-Tetramer, während die andere (Minder-)Population RBD-Tetramer beider Viren band. Wahrscheinlich könnten die kreuzreaktiven SARS-CoV-1/2-Klone ein konserviertes RBD-Epitop aufweisen, das ein wichtiges Ziel darstellt. Als nächstes wurden die Klone nach Einzelzellen sortiert und die zehn besten Klone mit der hellsten RBD-Tetramer-Färbung wurden sequenziert.

Säugetier-Expressionsvektoren wurden mit der DNA von RBD-spezifischen Nanokörpern kloniert und die Nanokörper wurden gereinigt. Die Autoren testeten mithilfe eines Ersatzvirus-Neutralisationstests (sVNT), ob die gereinigten Nanokörper die ACE2-RBD-Interaktion hemmten, und fanden vier Nanokörper-Klone (A11, B1, C8 und G8), die die Bindung hemmten. Bemerkenswert ist, dass nur der G8-Nanokörper kreuzreaktiv mit SARS-CoV-1/2 war.

Die RBD-Bindungskapazität der Nanobody-Klone wurde mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) bewertet. Die vier Nanokörper banden SARS-CoV-2 RBD mit mäßiger Affinität, während nur G8 das SARS-CoV-1 RBD band, wenn auch mit verringerter Affinität. Weitere SPR-basierte Experimente zeigten zwei unterschiedliche Bindungsmodi – einer beinhaltete die Bindung an ein gemeinsames Epitop (für A11-, B1- und C8-Konstrukte) und der andere an ein anderes Epitop (G8), das innerhalb des SARS-CoV-1 stärker konserviert war RBD.

Obwohl die Nanokörper moderate Affinitäten aufwiesen, war es unwahrscheinlich, dass sie die Infektion im Vergleich zu den verwendeten mehreren hochaffinen mAbs stark neutralisierten. Daher erstellten die Forscher eine Reihe von Nanokörperkonstrukten, um die Neutralisierungskapazität von Nanokörpermonomeren zu erhöhen. Es wurden die Nanobody-Klone mit den höchsten Affinitäten (G8 und B1) verwendet. Diese Verbesserungsexperimente umfassten drei verschiedene Strategien.

Zunächst wurde eine menschliche IgG1-Fc-Domäne mit den Nanokörpern (B1-Fc- und G8-Fc-Konstrukte) fusioniert. Zweitens wurden B1 und G8 über einen Glycin-Serin (GS)-Linker kovalent verbunden (biparatopische Konstrukte). Die biparatopischen (BP) Konstrukte wurden mit drei verschiedenen Linkerlängen (10, 19 und 39 Aminosäuren) generiert. Drittens wurden dimere biparatope Konstrukte unter Verwendung menschlicher IgG1-Fc-Domänen erzeugt. Ein Mikroneutralisationstest wurde durchgeführt, um zu testen, ob die Konstrukte eine SARS-CoV-2-Infektion hemmten.

Als Monomere hemmten B1 und G8 die Infektion mäßig; Die Fc-Dimerisierung beider Nanokörper verbesserte jedoch deren neutralisierende Aktivität. Bemerkenswert ist, dass die monomeren biparatopischen Konstrukte die Neutralisierung deutlich verstärkten und mit der Linkerlänge zunahmen. Die Fc-Dimerisierung biparatopischer Konstrukte führte zu einer starken neutralisierenden Aktivität; Sie waren jedoch weniger wirksam als ihre Monomer-Gegenstücke.

Darüber hinaus wurden die biparatopischen Nanokörper mithilfe eines Multiplex-RBD-Variantenarrays getestet, um ihre Fähigkeit zur Überwindung des Virusaustritts zu bewerten. Die Bindung von Nanokörpern an RBDs von besorgniserregenden SARS-CoV-2-Varianten (VOCs) und die RBD-ACE2-Hemmung wurden gemessen. Das G8-Fc-Konstrukt band mit hoher Wirksamkeit an alle getesteten Varianten, der B1-Fc-Nanokörper zeigte jedoch eine verringerte Bindung an RBDs der Beta- und Gamma-Variante sowie an solche, die E484D-, E484K-, Q493K- und S494P-Substitutionen enthielten.

Dennoch hatte der biparatopische Nanokörper mit einem 10-Aminosäuren-Linker (BP10) ein ähnliches Profil wie G8-Fc. Die Hemmung der RBD-ACE2-Interaktion wurde in einem Bead-basierten sVNT unter Verwendung von 20 verschiedenen RBDs getestet, darunter solche von SARS-CoV-1, Fledermaus- und Pangolin-Coronaviren sowie den Omicron BA.1- und BA.2-Varianten.

Die Ergebnisse ähnelten denen des Multiplex-Arrays. Allerdings konnten die Nanokörper-Konstrukte die Omicron-Varianten nicht neutralisieren. Abschließend wurden die Mäuse getrennt mit B1-Fc-, G8-Fc- und BP10-Fc-Konstrukten behandelt und nach 24 Stunden mit SARS-CoV-2 infiziert. Die Behandlung mit G8-Fc verringerte die Viruslast in der Lunge moderat. Im Gegensatz dazu waren mit B1-Fc oder BP10-Fc behandelte Mäuse vollständig geschützt.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend zeigte die Studie die Isolierung von SARS-CoV-2-neutralisierenden Nanokörpern mithilfe einer Hefe-Display-Bibliothek und dass die Erzeugung biparatopischer Nanokörper ihre neutralisierende Wirksamkeit offenbar aufgrund der Vernetzung verschiedener Spike-Proteine ​​verbessern könnte. Interessanterweise gelang es der Dimerisierung der biparatopischen Konstrukte nicht, die Neutralisierung im Vergleich zu ihren Monomer-Gegenstücken zu verstärken.

Referenz:

• Pymm, P. et al. (2022) „Biparatopische Nanokörper, die auf die Rezeptorbindungsdomäne abzielen, neutralisieren effizient SARS-CoV-2“, iScience, S. 105259. doi: 10.1016/j.isci.2022.105259. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004222015310