Секвенцията на последното четене революционизира диагностиката на редки заболявания

Секвенцията на последното четене революционизира диагностиката на редки заболявания

Един на всеки 10 души по света е засегнат от рядко генетично заболяване, но около 50% от тях остават недиагностицирани въпреки бързото нарастване на генетичните технологии и тестове. Дори ако човек има достъп до изследване, процесът на диагностика може да отнеме около пет години или повече, което понякога е твърде късно за пациентите, които често са деца, да започнат правилно лечение.

Това отчасти се дължи на факта, че настоящите клинични тестове използват метод, наречен секвениране на кратко четене, който няма достъп до информация в определени региони на генома и следователно не може да извърши решаващи доказателства за диагностика. Изследователите от UC Santa Cruz обаче се придвижват напред към авангарден алтернативен метод, наречен Lonad секвениране, който може да осигури по-изчерпателен набор от данни за идентифициране на вариации, да елиминира необходимостта от множество специализирани тестове и да оптимизира диагностиката на редки заболявания.

Ново проучване показва, че дълготрайното секвениране има потенциала да подобри честотата на диагностициране, като същевременно намалява времето за диагностициране от години на дни - в един тест и на много по-ниска цена. Проучването е публикувано вАмериканският журнал за човешка генетикаи ръководени от основните членове на професора по биомолекулярно инженерство (BME) на UCSC Genomic Institute (BME) Бенедикт Патен и доцента по BME Karen Miga, както и бившия постдокторантски учен на UCSC Jean Monlong.

Редките болести са нещо, с което хората са се борили толкова много години и ако имаме технология за секвениране, която оптимизира диагностичните тестове, това ще бъде огромен принос - и това е, което тествахме като част от тази статия. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. студент, първи автор на статията

„Днес диагностичният добив на генетичното секвениране е разочароващо нисък“, каза Патен. „Вероятна причина са непълните методи за секвениране, варианти и епигенетични сигнали в нашата кохорта.

Намерете редки болести

Това проучване се фокусира върху редки моногенни заболявания, причинени от разстройство на един ген.

Учените диагностицират генетични заболявания, като търсят в техния генетичен материал, за да намерят варианти - разлики в гена, които могат да му попречат да функционира правилно. Типичният подход за намиране на тези варианти използва техника, наречена секвениране на кратко четене, която картографира генетични базови двойки - комбинации от аденин (A), цитозин (C), гуанин (G) и тимин (T) - в последователности от около 150-250 всяка.

Въпреки това, ограничението на секвенирането на кратко четене е, че то може да пропусне важна информация в определени региони на генома, като модели на базови двойки, които са много по-дълги от само 250 базови двойки. Нито може да извърши „фазиране“, процесът на определяне кои варианти са наследени от майката и кои идват от бащата. Това може да помогне на клиницистите да открият кои варианти се наследяват. Например, когато два варианта са наследени от един и същи родител, по един от всеки родител или изобщо не са наследени. Това може да бъде много полезна информация за генетични диагнози, особено когато няма родителски данни.

За разлика от това, дълготрайното секвениране може да чете дълги участъци от ДНК едновременно, елиминирайки пропуски, които могат да накарат учените и клиницистите да пропуснат важна информация за генната вариация. Дългочетеното секвениране също така предоставя директни фазови данни, както и информация за метилирането, химичен процес в ДНК, който кара гените да се „включват или изключват“ и може да допринесе за заболяване.

„Дълготрайното секвениране ще бъде много по-добро в определени случаи и ние предприемаме стъпки, за да докажем това“, каза Неги.

Олово в методите

Изследователите от Института по геномика на UC Santa Cruz имат богата история на иновации и опит в дълготрайното секвениране и активно разработват методи за оптимизиране на секвенирането и анализа за широк спектър от приложения за здравни изследвания. Много от техниките, които изследователите са разработили за постигане на постижения, като първия наистина пълен референтен геном „теломер-теломер“, сега се използват за подобряване на резултатите за пациентите.

„Ако предишните констатации бяха подсилени, открихме, че ползите от използването на дълготрайно секвениране са значително увеличени чрез използване на пълен, така наречен референтен геном „теломер-теломер“ вместо съществуващата непълна, но широко използвана геномна референция“, каза MIGA. „Очакваме, че пангеномите – референции, представящи различни човешки вариации – ще се възползват още повече от новите технологии за дълготрайно секвениране.“

Лабораториите на Paten и Miga се обединиха с клиницисти, за да работят върху случаи на 42 пациенти с редки заболявания - някои от които бяха диагностицирани чрез методи за кратко четене или други специализирани тестове, някои от които все още не бяха диагностицирани. В някои случаи изследователите са имали достъп до генетичната информация на родителите, но в други не.

Дългоживеещото секвениране на пациентите беше проведено от лабораторията на MIGA с помощта на Nanopore секвениране, метод за дълготрайно секвениране в UCSC, за постигане на много точни, крайни четения на геномите на пациентите за приблизително $1000 на проба.

Геномните данни бяха анализирани с помощта на изчислителни методи, разработени в лабораторията на Paten, за да се намерят малки и големи варианти, фазови данни и данни за метилиране, всички с помощта на тръбопровод, наречен NAPU тръбопровод. Процесът на анализ отнема около ден или по-малко, в зависимост от скоростта на компютърната обработка, и струва $100.

решаване на случаи

След секвениране и анализиране на данните за пациентите, изследователите откриха, че показанията за дълго четене предоставят по-изчерпателен набор от данни в сравнение с това, което може да бъде получено чрез секвениране за кратко четене.

Секвенирането на дълго четене предостави убедителна диагноза за 11 от 42-те пациенти в кохортата, предоставяйки всичко от данните на кратко четене, както и допълнителна информация, включително допълнителни редки варианти на кандидати, фазиране на далечни разстояния и метилиране - всичко това в един, евтин и бърз протокол.

11-те диагностицирани случая включват четири вродени надбъбречни хипоплазии (рядко състояние, при което надбъбречните жлези са уголемени и не функционират правилно). Генът, отговорен за това заболяване, се намира в особено предизвикателна област на генома – той не може да бъде характеризиран с помощта на технология за секвениране на кратко четене, а настоящите клинични тестове са тромави и непълни.

„За да разрешим тези случаи, ние разработихме нов пангеномен инструмент, който интегрира нови висококачествени комплекти, като текущата позиция на референтния геном „теломери-теломери“ в INSERM във Франция. „Бяхме развълнувани да видим човешкия геном, който исторически е бил труден за изучаване. Нашите резултати ни насърчават да разширим нашия подход към повече заболявания, които отдавна са в застой."

В допълнение, два случая включват нарушения на половото развитие, докато рядък случай на хипоплазия на клетките на Лайдиг, дължащи се на недоразвити клетки на Лайдиг в тестисите, засяга половото развитие на мъжа. В допълнение, четири случая на разстройства на неврологичното развитие, всеки от които представлява дълги и предизвикателни диагностични одисеи, най-накрая бяха решени.

„Секвенирането с дълго четене е може би следващият най-добър тест за неразрешени случаи с убедителни варианти в един ген или ясен фенотип“, каза Неги. „Той може да служи като единичен диагностичен тест, намалявайки нуждата от множество клинични посещения и превръщайки едногодишно диагностично пътуване в броени часове.“

Средно, всеки пациент е имал 280 гена (включително някои гени на болестта на Мендел, свързани с наследствени заболявания, причинени от единични генни мутации) със значителни протеинови кодиращи области, които са ясно покрити от дълги четения и неоткрити при къси четения.

„Има толкова много повече от генома, че дългите четения могат да отключат“, каза Неги. „Но ще отнеме време, преди да можем напълно да интерпретираме тази нова информация, разкрита от дълги четения. Тези данни не присъстваха в нашите клинични бази данни. Четенията разкриват около 5,8% повече от генома от теломер до теломер, до който кратките четения просто не можаха да получат достъп.“

Други изследователи от UC Santa Cruz, участващи в това изследване, включват Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker и Sara O’Rourke.

Това изследване е финансирано отчасти от инициативата на Чан Зукърбърг.

източници: