Sekvenování posledního čtení přináší revoluci v diagnostice vzácných onemocnění

Sekvenování posledního čtení přináší revoluci v diagnostice vzácných onemocnění

Jeden z 10 lidí na celém světě je postižen vzácnou genetickou poruchou, ale asi 50 % z nich zůstává nediagnostikováno navzdory rychlému nárůstu genetických technologií a testování. I když má člověk přístup k testování, proces diagnózy může trvat přibližně pět let nebo déle, což je někdy příliš pozdě na to, aby pacienti, kteří jsou často děti, začali řádnou léčbu.

Částečně je to proto, že současné klinické testování používá metodu zvanou sekvenování krátkého čtení, které nemá přístup k informacím v určitých oblastech genomu, a proto nemůže provést zásadní důkaz pro diagnózu. Vědci z UC Santa Cruz však postupují vpřed k nejmodernější alternativní metodě zvané Lonad sekvenování, která může poskytnout komplexnější soubor dat pro identifikaci variací, eliminovat potřebu více specializovaných testů a optimalizovat diagnostiku vzácných onemocnění.

Nová studie ukazuje, že dlouhodobé sekvenování má potenciál zlepšit míru diagnózy a zároveň zkrátit dobu do diagnózy z let na dny – v jediném testu a za mnohem nižší náklady. Studie byla zveřejněna vAmerický žurnál lidské genetikya vedeny hlavními členy Genomického institutu UCSC, profesorem biomolekulárního inženýrství (BME) Benediktem Patenem a docentkou BME Karen Miga, a také bývalým postdoktorandem UCSC Jeanem Monlongem.

Vzácná onemocnění jsou něco, s čím lidé bojují tolik let, a pokud budeme mít technologii sekvenování, která optimalizuje diagnostické testování, bude to obrovský přínos – a to jsme testovali v rámci tohoto dokumentu. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. student, první autor příspěvku

"Dnes je diagnostický výtěžek genetického sekvenování frustrující nízký," řekl Paten. „Pravděpodobnou příčinou jsou neúplné sekvenační metody, varianty a epigenetické signály v naší kohortě.

Najděte vzácná onemocnění

Tato studie se zaměřila na vzácná monogenní onemocnění způsobená poruchou jednoho genu.

Vědci diagnostikují genetická onemocnění prohledáváním jejich genetického materiálu, aby našli varianty – rozdíly v genu, které mu mohou bránit ve správném fungování. Typický přístup k nalezení těchto variant používá techniku ​​zvanou sekvenování krátkého čtení, které mapuje páry genetických bází – kombinace adeninu (A), cytosinu (C), guaninu (G) a thyminu (T) – v sekvencích po asi 150-250.

Omezení krátkého sekvenování je však v tom, že může postrádat zásadní informace v určitých oblastech genomu, jako jsou vzory párů bází, které jsou mnohem delší než pouhých 250 párů bází. Nemůže také provádět „fázování“, proces určování, které varianty jsou zděděny od matky a které pocházejí od otce. To může lékařům pomoci zjistit, které varianty jsou dědičné. Například, když jsou dvě varianty zděděny od stejného rodiče, jedna od každého rodiče nebo nejsou zděděny vůbec. To může být velmi užitečná informace pro genetické diagnózy, zvláště když nejsou k dispozici údaje rodičů.

Naproti tomu sekvenování s dlouhou životností může číst dlouhé úseky DNA současně, čímž se eliminují mezery, které mohou způsobit, že vědci a lékaři přehlédnou důležité informace o variaci genů. Sekvenování s dlouhým čtením také poskytuje přímá fázová data a také informace o methylaci, chemickém procesu v DNA, který způsobuje, že se geny „zapínají nebo vypínají“ a mohou přispívat k onemocnění.

"Dlouhotrvající sekvenování bude v určitých případech mnohem lepší a podnikáme kroky, abychom to dokázali," řekl Negi.

Olovo v metodách

Výzkumní pracovníci UC Santa Cruz Genomics Institute mají rozsáhlou historii inovací a odborných znalostí v dlouhodobém sekvenování a aktivně vyvíjejí metody pro optimalizaci sekvenování a analýzy pro širokou škálu aplikací v oblasti zdravotního výzkumu. Mnoho technik, které výzkumníci vyvinuli, aby dosáhli úspěchů, jako je první skutečně kompletní referenční genom „telomera-telomera“, se nyní používá ke zlepšení výsledků pacientů.

"Pokud byla posílena předchozí zjištění, zjistili jsme, že výhody použití dlouhodobého sekvenování byly výrazně zvýšeny použitím kompletního, takzvaného "telomer-telomer" referenčního genomu namísto stávající neúplné, ale široce používané genomové reference, " řekl MIGA. "Předpokládáme, že pangenomy - reference představující rozmanité lidské variace - budou mít z nových sekvenačních technologií s dlouhou životností ještě větší užitek."

Laboratoře společnosti Paten a Miga se spojily s klinickými lékaři, aby pracovali na případech 42 pacientů se vzácnými onemocněními – někteří z nich byli diagnostikováni pomocí krátkých metod nebo jiných specializovaných testů, někteří z nich ještě nebyli diagnostikováni. V některých případech měli vědci přístup ke genetickým informacím rodičů, ale v jiných ne.

Laboratoř MIGA provedla dlouhodobé sekvenování pacientů pomocí sekvenování Nanopore, což je metoda dlouhodobého sekvenování v UCSC, aby bylo dosaženo vysoce přesných, úplných čtení genomů pacientů za přibližně 1 000 USD za vzorek.

Genomická data byla analyzována pomocí výpočetních metod vyvinutých v laboratoři Paten za účelem nalezení malých a velkých variant, fázových dat a metylačních dat, vše pomocí potrubí zvaného NAPU pipeline. Proces analýzy trvá asi den nebo méně v závislosti na rychlosti počítačového zpracování a stojí 100 USD.

řešit případy

Po sekvenování a analýze dat pacientů výzkumníci zjistili, že dlouhé čtení poskytlo komplexnější soubor dat ve srovnání s tím, co lze odvodit pomocí sekvenování krátkého čtení.

Sekvenování s dlouhým čtením poskytlo přesvědčivou diagnózu pro 11 ze 42 pacientů v kohortě a poskytlo vše od krátkých dat i další informace včetně dalších vzácných kandidátních variant, fázování na dlouhé vzdálenosti a metylace – vše v jediném, levném a rychlém protokolu.

11 diagnostikovaných případů zahrnovalo čtyři vrozené adrenální hypoplazie (vzácné onemocnění, při kterém jsou nadledvinky zvětšené a nefungují správně). Gen odpovědný za toto onemocnění se nachází ve zvláště náročné oblasti genomu – nelze jej charakterizovat pomocí technologie sekvenování krátkého čtení a současné klinické testování je těžkopádné a neúplné.

"Abychom tyto případy vyřešili, vyvinuli jsme nový pan-genomický nástroj, který integruje nové vysoce kvalitní sestavy, jako je současná pozice referenčního genomu "telomeres-telomeres" na INSERM ve Francii." Byli jsme nadšeni, že vidíme lidský genom, který bylo historicky obtížné studovat. Naše výsledky nás povzbuzují, abychom rozšířili náš přístup k dalším nemocem, které byly dlouho pozastaveny."

Kromě toho dva případy zahrnovaly poruchy sexuálního vývoje, zatímco vzácný případ hypoplazie Leydigových buněk v důsledku nedostatečně vyvinutých Leydigových buněk ve varlatech ovlivnil mužský sexuální vývoj. Kromě toho byly konečně vyřešeny čtyři případy neurovývojových poruch, z nichž každý představuje dlouhou a náročnou diagnostickou odyseu.

"Dlouhé čtení sekvenování je pravděpodobně dalším nejlepším testem pro nevyřešené případy s přesvědčivými variantami v jediném genu nebo jasným fenotypem," řekl Negi. "Může sloužit jako jediný diagnostický test, snižuje potřebu více klinických návštěv a přeměňuje roky trvající diagnostickou cestu na záležitost hodin."

V průměru měl každý pacient 280 genů (včetně některých genů Mendelovy choroby spojených s dědičnými chorobami způsobenými mutacemi jednoho genu) s významnými oblastmi kódujícími proteiny, které jsou jasně pokryty dlouhými čteními a nedetekovány krátkými čteními.

"Je toho mnohem více z genomu, že dlouhé čtení může odemknout," řekl Negi. "Bude to ale nějakou dobu trvat, než budeme moci plně interpretovat tyto nové informace odhalené dlouhým čtením. Tato data nebyla přítomna v našich klinických databázích. Čtení odhaluje asi o 5,8 % více genomu telomery k telomeru, ke kterému se krátké čtení jednoduše nedostalo."

Mezi další výzkumníky UC Santa Cruz zapojené do tohoto výzkumu patří Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker a Sara O’Rourke.

Tento výzkum byl částečně financován iniciativou Chan Zuckerberg.

Zdroje: