Sidst læste sekvensering revolutionerer diagnosticering af sjældne sygdomme

Sidst læste sekvensering revolutionerer diagnosticering af sjældne sygdomme

En ud af 10 mennesker på verdensplan er ramt af en sjælden genetisk lidelse, men omkring 50 % af dem forbliver udiagnosticerede på trods af hurtige stigninger i genetisk teknologi og testning. Selv hvis en person har adgang til test, kan diagnoseprocessen tage omkring fem år eller længere, hvilket nogle gange er for sent for patienter, som ofte er børn, til at begynde ordentlig behandling.

Dette skyldes til dels, at den nuværende kliniske afprøvning bruger en metode kaldet short-read sekventering, som ikke kan få adgang til information i visse områder af genomet og derfor ikke kan udføre afgørende beviser for diagnosen. Men UC Santa Cruz-forskere bevæger sig fremad til en banebrydende alternativ metode, kaldet Lonad-sekventering, der kan give et mere omfattende datasæt til at identificere variationer, eliminere behovet for flere specialiserede tests og optimere diagnosen af ​​sjældne sygdomme.

En ny undersøgelse viser, at langvarig sekventering har potentialet til at forbedre diagnosehastigheden og samtidig reducere tiden til diagnose fra år til dage - i en enkelt test og til en meget lavere pris. Undersøgelsen blev offentliggjort iAmerican Journal of Human Geneticsog ledet af kernemedlemmer af UCSC Genomic Institute Professor of Biomolecular Engineering (BME) Benedikt Paten og Associate Professor of BME Karen Miga, samt tidligere UCSC postdoc Jean Monlong.

Sjældne sygdomme er noget, som folk har kæmpet med i så mange år, og hvis vi har sekventeringsteknologi, der optimerer diagnostisk testning, vil det være et kæmpe bidrag – og det er det, vi testede som en del af dette papir. “

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. studerende, første forfatter af papiret

"I dag er det diagnostiske udbytte af genetisk sekventering frustrerende lavt," sagde Paten. "En sandsynlig årsag er de ufuldstændige sekventeringsmetoder, varianter og epigenetiske signaler i vores kohorte.

Find sjældne sygdomme

Denne undersøgelse fokuserede på sjældne monogene sygdomme forårsaget af en lidelse i et enkelt gen.

Forskere diagnosticerer genetiske sygdomme ved at søge gennem deres genetiske materiale for at finde varianter - forskelle i et gen, der kan forhindre det i at fungere korrekt. Den typiske tilgang til at finde disse varianter bruger en teknik kaldet kortlæst sekventering, som kortlægger genetiske basepar - kombinationer af adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og thymin (T) - i sekvenser på omkring 150-250 hver.

Begrænsningen ved kortlæst sekventering er imidlertid, at den kan gå glip af afgørende information i visse områder af genomet, såsom mønstre af basepar, der er meget længere end blot 250 basepar. Den kan heller ikke udføre "phasing", processen med at bestemme, hvilke varianter der er arvet fra moderen, og hvilke der kommer fra faderen. Dette kan hjælpe klinikere med at opdage, hvilke varianter der er arvet. For eksempel, når to varianter er nedarvet fra den samme forælder, en fra hver forælder eller slet ikke nedarves. Dette kan være meget nyttig information til genetiske diagnoser, især når forældredata ikke er tilgængelige.

I modsætning hertil kan langvarig sekventering læse lange strækninger af DNA samtidigt, hvilket eliminerer huller, der kan få forskere og klinikere til at gå glip af vigtig information om genvariation. Langlæst sekventering giver også direkte fasedata samt information om methylering, en kemisk proces i DNA, der får gener til at blive "tændt eller slukket" og kan bidrage til sygdom.

"Langlivet sekventering vil være meget bedre i visse tilfælde, og vi tager skridt til at bevise det," sagde Negi.

Led i metoder

UC Santa Cruz Genomics Institute-forskere har en omfattende historie med innovation og ekspertise inden for langtidsholdbar sekventering og udvikler aktivt metoder til at optimere sekventering og analyse til en bred vifte af sundhedsforskningsapplikationer. Mange af de teknikker, som forskere udviklede for at opnå resultater, såsom det første virkelig komplette "telomere-telomere" referencegenom, bliver nu brugt til at forbedre patientresultaterne.

"Hvis tidligere fund blev forstærket, fandt vi ud af, at fordelene ved at bruge langlivet sekventering blev væsentligt forøget ved at bruge et komplet, såkaldt 'telomere-telomere' referencegenom i stedet for den eksisterende ufuldstændige, men udbredte genomiske reference," sagde MIGA. "Vi forventer, at pangenomer - referencer, der repræsenterer forskelligartet menneskelig variation - vil drage endnu mere fordel af nye langlivede sekventeringsteknologier."

Paten og Migas laboratorier gik sammen med klinikere for at arbejde på sager om 42 patienter med sjældne sygdomme - hvoraf nogle blev diagnosticeret gennem kortlæsningsmetoder eller andre specialiserede tests, hvoraf nogle endnu ikke var diagnosticeret. I nogle tilfælde havde forskere adgang til forældres genetiske information, men i andre havde de ikke.

Langtidssekventering af patienterne blev udført af MIGA-laboratoriet ved hjælp af Nanopore-sekventering, en langlivet sekventeringsmetode ved UCSC, for at opnå meget nøjagtige, ende-til-ende-aflæsninger af patienternes genomer for ca. $1.000 pr. prøve.

De genomiske data blev analyseret ved hjælp af beregningsmetoder udviklet i Paten-laboratoriet for at finde små og store varianter, fasedata og methyleringsdata, alt sammen ved hjælp af en pipeline kaldet NAPU-pipeline. Analyseprocessen tager omkring en dag eller mindre, afhængigt af computerbehandlingens hastighed, og koster $100.

løse sager

Efter sekventering og analyse af patientdata fandt forskerne ud af, at langlæste aflæsninger gav et mere omfattende datasæt sammenlignet med, hvad der kan udledes ved brug af kortlæst sekvensering.

Langlæst sekventering gav en afgørende diagnose for 11 af de 42 patienter i kohorten, og gav alt fra de kortlæste data samt yderligere information, herunder yderligere sjældne kandidatvarianter, langsigtet fasering og methylering - alt sammen i en enkelt, billig og hurtig protokol.

De 11 diagnosticerede tilfælde omfattede fire medfødte binyrehypoplasier (en sjælden tilstand, hvor binyrerne er forstørrede og ikke fungerer korrekt). Genet, der er ansvarligt for denne sygdom, er placeret i et særligt udfordrende område af genomet - det kan ikke karakteriseres ved hjælp af kortlæst sekventeringsteknologi, og den nuværende kliniske test er besværlig og ufuldstændig.

"For at løse disse sager har vi udviklet et nyt pan-genomisk værktøj, der integrerer nye højkvalitetssamlinger, såsom referencegenomet "telomeres-telomeres" nuværende position hos INSERM i Frankrig. "Vi var spændte på at se det menneskelige genom, som historisk har været svært at studere. Vores resultater opmuntrer os til at udvide vores tilgang til flere sygdomme, der længe er gået i stå."

Derudover involverede to tilfælde forstyrrelser i den seksuelle udvikling, mens et sjældent tilfælde af Leydig-cellehypoplasi på grund af underudviklede Leydig-celler i testiklerne påvirkede den mandlige seksuelle udvikling. Derudover er fire tilfælde af neuroudviklingsforstyrrelser, der hver repræsenterer lange og udfordrende diagnostiske odysséer, endelig blevet løst.

"Langlæst sekventering er sandsynligvis den næstbedste test for uløste tilfælde med overbevisende varianter i et enkelt gen eller en klar fænotype," sagde Negi. "Det kan fungere som en enkelt diagnostisk test, der reducerer behovet for flere kliniske besøg og konverterer en årelang diagnostisk rejse til et spørgsmål om timer."

I gennemsnit havde hver patient 280 gener (inklusive nogle Mendelske sygdomsgener forbundet med arvelige sygdomme forårsaget af enkelte genmutationer) med signifikante proteinkodende områder, der tydeligt er dækket af lange læsninger og uopdaget af korte læsninger.

"Der er så meget mere af genomet, som de lange læsninger kan låse op," sagde Negi. "Men det vil tage tid, før vi fuldt ud kan fortolke denne nye information afsløret ved lange læsninger. Disse data var ikke til stede i vores kliniske databaser. Læsninger afslører omkring 5,8 % mere af telomer-til-telomer-genomet, som korte læsninger simpelthen ikke kunne få adgang til."

Andre UC Santa Cruz forskere involveret i denne forskning omfatter Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker og Sara O'Rourke.

Denne forskning blev delvist finansieret af Chan Zuckerberg Initiative.

Kilder: