Η αλληλουχία της τελευταίας ανάγνωσης φέρνει επανάσταση στη διάγνωση σπάνιων ασθενειών

Η αλληλουχία της τελευταίας ανάγνωσης φέρνει επανάσταση στη διάγνωση σπάνιων ασθενειών

Ένας στους 10 ανθρώπους παγκοσμίως επηρεάζεται από μια σπάνια γενετική διαταραχή, αλλά περίπου το 50% από αυτούς παραμένει αδιάγνωστο παρά τις ραγδαίες αυξήσεις της γενετικής τεχνολογίας και των δοκιμών. Ακόμη και αν ένα άτομο έχει πρόσβαση σε εξετάσεις, η διαδικασία της διάγνωσης μπορεί να διαρκέσει περίπου πέντε χρόνια ή περισσότερο, κάτι που μερικές φορές είναι πολύ αργά για τους ασθενείς, που είναι συχνά παιδιά, να ξεκινήσουν την κατάλληλη θεραπεία.

Αυτό οφείλεται εν μέρει στο ότι οι τρέχουσες κλινικές δοκιμές χρησιμοποιούν μια μέθοδο που ονομάζεται αλληλουχία σύντομης ανάγνωσης, η οποία δεν μπορεί να έχει πρόσβαση σε πληροφορίες σε ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος και επομένως δεν μπορεί να εκτελέσει κρίσιμα στοιχεία για τη διάγνωση. Ωστόσο, οι ερευνητές του UC Santa Cruz προχωρούν σε μια εναλλακτική μέθοδο αιχμής, που ονομάζεται Lonad sequencing, η οποία μπορεί να παρέχει ένα πιο ολοκληρωμένο σύνολο δεδομένων για τον εντοπισμό παραλλαγών, να εξαλείψει την ανάγκη για πολλαπλές εξειδικευμένες δοκιμές και να βελτιστοποιήσει τη διάγνωση σπάνιων ασθενειών.

Μια νέα μελέτη δείχνει ότι η μακροχρόνια αλληλουχία έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τα ποσοστά διάγνωσης, ενώ μειώνει τον χρόνο για τη διάγνωση από χρόνια σε ημέρες - σε μία μόνο εξέταση και με πολύ χαμηλότερο κόστος. Η μελέτη δημοσιεύτηκε στοThe American Journal of Human Geneticsκαι με επικεφαλής τα βασικά μέλη του Γονιδιωματικού Ινστιτούτου UCSC, τον καθηγητή Βιομοριακής Μηχανικής (BME) Benedikt Paten και τον Αναπληρωτή Καθηγητή του BME Karen Miga, καθώς και τον πρώην μεταδιδακτορικό υπότροφο του UCSC, Jean Monlong.

Οι σπάνιες ασθένειες είναι κάτι με το οποίο οι άνθρωποι παλεύουν τόσα πολλά χρόνια, και αν έχουμε τεχνολογία αλληλούχισης που βελτιστοποιεί τις διαγνωστικές δοκιμές, αυτό θα είναι μια τεράστια συνεισφορά - και αυτό είναι που δοκιμάσαμε ως μέρος αυτής της εργασίας. "

Shloka Negi, UC Santa Cruz Bme Ph.D. μαθητής, πρώτος συγγραφέας της εργασίας

«Σήμερα, η διαγνωστική απόδοση της γενετικής αλληλουχίας είναι απογοητευτικά χαμηλή», είπε ο Πάτεν. «Μια πιθανή αιτία είναι οι ελλιπείς μέθοδοι αλληλούχισης, οι παραλλαγές και τα επιγενετικά σήματα στην κοόρτη μας.

Βρείτε σπάνιες ασθένειες

Αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε σε σπάνιες μονογονιδιακές ασθένειες που προκαλούνται από διαταραχή ενός μόνο γονιδίου.

Οι επιστήμονες διαγιγνώσκουν γενετικές ασθένειες ψάχνοντας στο γενετικό τους υλικό για να βρουν παραλλαγές - διαφορές σε ένα γονίδιο που μπορεί να το εμποδίσει να λειτουργήσει σωστά. Η τυπική προσέγγιση για την εύρεση αυτών των παραλλαγών χρησιμοποιεί μια τεχνική που ονομάζεται σύντομη ανάγνωση αλληλουχίας, η οποία χαρτογραφεί γενετικά ζεύγη βάσεων - συνδυασμούς αδενίνης (Α), κυτοσίνης (C), γουανίνης (G) και θυμίνης (Τ) - σε αλληλουχίες περίπου 150-250 το καθένα.

Ωστόσο, ο περιορισμός της σύντομης ανάγνωσης αλληλουχίας είναι ότι μπορεί να χάσει κρίσιμες πληροφορίες σε ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος, όπως σχέδια ζευγών βάσεων που είναι πολύ μεγαλύτερα από μόλις 250 ζεύγη βάσεων. Ούτε μπορεί να εκτελέσει «φάσεις», τη διαδικασία προσδιορισμού ποιες παραλλαγές κληρονομούνται από τη μητέρα και ποιες προέρχονται από τον πατέρα. Αυτό μπορεί να βοηθήσει τους κλινικούς γιατρούς να ανακαλύψουν ποιες παραλλαγές κληρονομούνται. Για παράδειγμα, όταν δύο παραλλαγές κληρονομούνται από τον ίδιο γονέα, μία από κάθε γονέα ή δεν κληρονομείται καθόλου. Αυτό μπορεί να είναι πολύ χρήσιμες πληροφορίες για γενετικές διαγνώσεις, ειδικά όταν τα γονικά δεδομένα δεν είναι διαθέσιμα.

Αντίθετα, η μακροχρόνια αλληλουχία μπορεί να διαβάσει μεγάλες εκτάσεις DNA ταυτόχρονα, εξαλείφοντας τα κενά που μπορεί να κάνουν τους επιστήμονες και τους κλινικούς γιατρούς να χάνουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη γονιδιακή παραλλαγή. Η μακροχρόνια αλληλουχία παρέχει επίσης δεδομένα άμεσης φάσης καθώς και πληροφορίες σχετικά με τη μεθυλίωση, μια χημική διαδικασία στο DNA που προκαλεί την «ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση» των γονιδίων και μπορεί να συμβάλει στην εμφάνιση ασθένειας.

«Η μακροχρόνια αλληλουχία θα είναι πολύ καλύτερη σε ορισμένες περιπτώσεις και λαμβάνουμε μέτρα για να το αποδείξουμε αυτό», είπε ο Negi.

Πρωτοπορία στις μεθόδους

Οι ερευνητές του Ινστιτούτου Γονιδιωματικής του UC Santa Cruz έχουν εκτεταμένο ιστορικό καινοτομίας και τεχνογνωσίας στον μακρόβιο προσδιορισμό αλληλουχίας και αναπτύσσουν ενεργά μεθόδους για τη βελτιστοποίηση της αλληλουχίας και της ανάλυσης για ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών έρευνας για την υγεία. Πολλές από τις τεχνικές που ανέπτυξαν οι ερευνητές για να επιτύχουν επιτεύγματα, όπως το πρώτο πραγματικά πλήρες γονιδίωμα αναφοράς «τελομερών-τελομερών», χρησιμοποιούνται τώρα για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων των ασθενών.

«Εάν τα προηγούμενα ευρήματα ενισχύθηκαν, διαπιστώσαμε ότι τα οφέλη από τη χρήση αλληλουχίας μακράς διάρκειας αυξήθηκαν σημαντικά με τη χρήση ενός πλήρους, αποκαλούμενου γονιδιώματος αναφοράς «τελομερούς-τελομερούς» αντί της υπάρχουσας ατελούς αλλά ευρέως χρησιμοποιούμενης γονιδιωματικής αναφοράς», δήλωσε η MIGA. «Αναμένουμε ότι τα πανγονιδιώματα - αναφορές που αντιπροσωπεύουν ποικίλες ανθρώπινες παραλλαγές - θα ωφεληθούν ακόμη περισσότερο από τις νέες μακρόβιες τεχνολογίες αλληλούχισης».

Τα εργαστήρια της Paten και της Miga συνεργάστηκαν με κλινικούς γιατρούς για να εργαστούν σε περιπτώσεις 42 ασθενών με σπάνιες ασθένειες - μερικοί από τους οποίους διαγνώστηκαν μέσω μεθόδων σύντομης ανάγνωσης ή άλλων εξειδικευμένων εξετάσεων, ορισμένοι από τους οποίους δεν είχαν ακόμη διαγνωστεί. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι ερευνητές είχαν πρόσβαση στις γενετικές πληροφορίες των γονέων, αλλά σε άλλες όχι.

Η μακρόβια αλληλουχία των ασθενών διεξήχθη από το εργαστήριο MIGA χρησιμοποιώντας την αλληλουχία Nanopore, μια μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας μακράς διάρκειας στο UCSC, για να επιτευχθούν εξαιρετικά ακριβείς, από άκρο σε άκρο αναγνώσεις του γονιδιώματος των ασθενών για περίπου 1.000 $ ανά δείγμα.

Τα γονιδιωματικά δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας υπολογιστικές μεθόδους που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο Paten για την εύρεση μικρών και μεγάλων παραλλαγών, δεδομένων φάσης και δεδομένων μεθυλίωσης, όλα χρησιμοποιώντας έναν αγωγό που ονομάζεται αγωγός NAPU. Η διαδικασία ανάλυσης διαρκεί περίπου μία ημέρα ή λιγότερο, ανάλογα με την ταχύτητα επεξεργασίας του υπολογιστή και κοστίζει 100 $.

λύσει υποθέσεις

Μετά την αλληλουχία και την ανάλυση των δεδομένων ασθενών, οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι οι μακροχρόνιες αναγνώσεις παρείχαν ένα πιο ολοκληρωμένο σύνολο δεδομένων σε σύγκριση με αυτό που μπορεί να προκύψει με τη χρήση της αλληλουχίας σύντομης ανάγνωσης.

Η αλληλουχία μακράς ανάγνωσης παρείχε μια οριστική διάγνωση για 11 από τους 42 ασθενείς της κοόρτης, παρέχοντας τα πάντα, από τα δεδομένα σύντομης ανάγνωσης καθώς και πρόσθετες πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων πρόσθετων σπάνιων υποψήφιων παραλλαγών, φάσης μεγάλης εμβέλειας και μεθυλίωσης - όλα σε ένα ενιαίο, φθηνό και γρήγορο πρωτόκολλο.

Οι 11 περιπτώσεις που διαγνώστηκαν περιελάμβαναν τέσσερις συγγενείς υποπλασίες των επινεφριδίων (μια σπάνια πάθηση κατά την οποία τα επινεφρίδια είναι διευρυμένα και δεν λειτουργούν σωστά). Το γονίδιο που ευθύνεται για αυτήν την ασθένεια βρίσκεται σε μια ιδιαίτερα προκλητική περιοχή του γονιδιώματος – δεν μπορεί να χαρακτηριστεί με τη χρήση τεχνολογίας σύντομης ανάγνωσης αλληλουχίας και οι τρέχουσες κλινικές δοκιμές είναι επίπονες και ελλιπείς.

«Για να λύσουμε αυτές τις περιπτώσεις, έχουμε αναπτύξει ένα νέο παν-γονιδιωματικό εργαλείο που ενσωματώνει νέα συγκροτήματα υψηλής ποιότητας, όπως το γονιδίωμα αναφοράς «τελομερή-τελομερή» στην τρέχουσα θέση στο INSERM στη Γαλλία. «Είμαστε ενθουσιασμένοι που είδαμε το ανθρώπινο γονιδίωμα, το οποίο ιστορικά ήταν δύσκολο να μελετηθεί. Τα αποτελέσματά μας μας ενθαρρύνουν να επεκτείνουμε την προσέγγισή μας σε περισσότερες ασθένειες που έχουν καθυστερήσει εδώ και καιρό».

Επιπλέον, δύο περιπτώσεις αφορούσαν διαταραχές της σεξουαλικής ανάπτυξης, ενώ μια σπάνια περίπτωση υποπλασίας των κυττάρων Leydig λόγω μη ανεπτυγμένων κυττάρων Leydig στους όρχεις επηρέασε την ανδρική σεξουαλική ανάπτυξη. Επιπλέον, τέσσερις περιπτώσεις νευροαναπτυξιακών διαταραχών, η καθεμία αντιπροσωπεύει μακροχρόνιες και προκλητικές διαγνωστικές οδύσσειες, έχουν επιτέλους επιλυθεί.

«Η αλληλουχία μακράς ανάγνωσης είναι πιθανώς το επόμενο καλύτερο τεστ για άλυτες περιπτώσεις με συναρπαστικές παραλλαγές σε ένα μόνο γονίδιο ή σαφή φαινότυπο», είπε ο Negi. «Μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ενιαίο διαγνωστικό τεστ, μειώνοντας την ανάγκη για πολλαπλές κλινικές επισκέψεις και μετατρέποντας ένα διαγνωστικό ταξίδι πολλών ετών σε λίγες ώρες».

Κατά μέσο όρο, κάθε ασθενής είχε 280 γονίδια (συμπεριλαμβανομένων ορισμένων γονιδίων της νόσου του Μεντελίου που σχετίζονται με κληρονομικές ασθένειες που προκαλούνται από μονογονιδιακές μεταλλάξεις) με σημαντικές περιοχές κωδικοποίησης πρωτεΐνης που καλύπτονται σαφώς από μεγάλες αναγνώσεις και δεν ανιχνεύονται από σύντομες αναγνώσεις.

«Υπάρχει πολύ περισσότερο γονιδίωμα που οι μακροχρόνιες αναγνώσεις μπορούν να ξεκλειδώσουν», είπε ο Νέγκι. "Αλλά θα χρειαστεί χρόνος για να μπορέσουμε να ερμηνεύσουμε πλήρως αυτές τις νέες πληροφορίες που αποκαλύφθηκαν από μακροχρόνιες αναγνώσεις. Αυτά τα δεδομένα δεν υπήρχαν στις κλινικές βάσεις δεδομένων μας. Οι αναγνώσεις αποκαλύπτουν περίπου 5,8% περισσότερο του γονιδιώματος τελομερούς σε τελομερές στο οποίο οι σύντομες αναγνώσεις απλά δεν μπορούσαν να έχουν πρόσβαση."

Άλλοι ερευνητές του UC Santa Cruz που συμμετείχαν σε αυτήν την έρευνα είναι οι Brandy McNulty, Ivo Violich, Joshua Gardner, Todd Hillaker και Sara O'Rourke.

Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από την Πρωτοβουλία Chan Zuckerberg.

Πηγές: